王 萍，朱 淵，喬勇升，張占林

(江蘇省泰州市藥品檢驗院，江蘇 泰州 225300)

銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是一種重要的革蘭氏陰性致病菌，廣泛存在于自然界中,營養(yǎng)要求低，喜歡潮濕的環(huán)境，對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素具有很強的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病[1]。剛出廠的包裝飲用水中銅綠假單胞菌數(shù)量較少，但因其消費周期較長，保存期至少半個月以上，兼性化能自養(yǎng)代謝而對有機營養(yǎng)要求低的銅綠假單胞菌可生長繁殖達到104cfu/mL[2]。2015年更新實施的GB 19298—2014《食品安全國家標準包裝飲用水》在原有微生物限量方面增設(shè)了銅綠假單胞菌5次抽樣作為檢測指標。近年來，隨著國內(nèi)桶裝飲用水消費量的不斷上升，有關(guān)銅綠假單胞菌污染桶裝水的報道也逐漸增多[3-7]，引起了諸多學(xué)者和消費者的關(guān)注。

GB 8538.57—2016是飲用天然礦泉水中銅綠假單胞菌的檢驗方法，但日常的檢測工作中卻發(fā)現(xiàn)該方法不是很完善，給檢驗工作帶來一定的困擾，張帆等[8]研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)GB 8538.57—2016鑒定出的銅綠假單胞菌中會出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；潘盂泉[9]指出其24～48 h的培養(yǎng)條件經(jīng)常無法對銅綠假單胞菌進行準確計數(shù)。本文中，筆者采用GB 8538.57—2016、VITEK 2 Compact、API 20E、16S rRNA基因序列分析4種常用的檢測方法對從桶裝水中分離得到的菌落形態(tài)可疑的25株野生型菌株進行復(fù)核驗證鑒定，并對鑒定結(jié)果進行比較、分析，旨在對銅綠假單胞菌的快速分離與準確鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

銅綠假單胞菌CGMCC1.10274購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，其余YS-465等共25株菌株為筆者按照國家標準GB 8538.57—2016飲用天然礦泉水檢驗方法從桶裝水樣品中分離保存的野生型菌株。

1.2 儀器與試劑

營養(yǎng)肉湯、平板計數(shù)瓊脂、CN假單胞選擇性培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；乙酰胺肉湯、納氏試劑，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司和廣州環(huán)凱有限公司各買一套；Taq酶等PCR試劑，大連寶生物工程有限公司；16S rRNA引物序列，上海生工生物有限公司合成；Tween 20，上海生工生物公司；革蘭氏陰性細菌鑒定卡(GN鑒定卡)及腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒(API 20E)，梅里埃生物有限公司；QIAxcel高解析DNA分析試劑盒，QIAGEN公司。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用并通過了質(zhì)量驗收。

VITEK 2 Compact微生物鑒定儀，法國梅里埃生物有限公司；PCR儀，默飛世爾科技公司；QIX核酸蛋白分析儀，QIAGEN公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

從標準菌株CGMCC1.10274、YS-465、YS-534、YS-536、YS-635、YS-682、YS-685、YS-686、YS-711、YS-2504、YS-2508、YS-2511、YS-3365、YS-3366、YS-3367、YS-463、YS-531、YS-535、YS-574、YS-634、YS-923、YS-1066、YS-1104、YS-1498、YS-1499及YS-2505共25株野生型菌株的保藏管中各挑取一環(huán)菌液，分別劃線接種于平板計數(shù)平板上，36 ℃過夜培養(yǎng)復(fù)蘇菌株，然后繼續(xù)傳代一次，得到活化菌株備用。

1.3.2 乙酰胺肉湯試驗

將活化的純培養(yǎng)物分別接種到陸橋和環(huán)凱兩個不同廠家的乙酰胺液體培養(yǎng)基中，36 ℃過夜培養(yǎng)20～24 h，按照廠家說明書向每個培養(yǎng)物中滴加1～2滴納氏試劑，立刻觀察，若出現(xiàn)磚紅色，則為陽性，否則為陰性。每株菌株重復(fù)進行3次實驗。

1.3.3 VITEK生化鑒定

按照VITEK 2 Compact全自動生化鑒定系統(tǒng)操作流程及GN卡使用說明書對分離保存的野生型菌株進行鑒定，每株菌株重復(fù)3次上機實驗。

1.3.4 API 20E試劑盒生化鑒定

具體操作按照API 20E試劑盒使用說明書操作，最后將生化結(jié)果輸入鑒定軟件得到鑒定結(jié)果。每株菌株重復(fù)進行3次實驗。

1.3.5 菌落PCR擴增16S rRNA

將3種方法都鑒定為銅綠假單胞菌的13株菌株、3種方法鑒定結(jié)果不一致的6株可疑菌株和標準菌株CGMCC1.10274進行16S rRNA PCR擴增。16S rRNA引物序列：27f：5′-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′，1492R：5′-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′[10]。擴增體系(25 μL)如下。模板：用一次性接種針挑少量菌體，10×Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，20%吐溫(Tween 20/無菌水：V/V)2 μL，正反向引物(10 μmol/L)各為1.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，無菌去離子水補至25 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，此步驟共35個循環(huán)；最后25 ℃冷卻5 min。所得PCR產(chǎn)物通過QIX核酸蛋白分析系統(tǒng)檢測。

1.3.6 測序比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

16S rRNA由上海生工生物工程有限公司完成測序工作，并在NCBI上用BLAST進行同源性比較。從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中下載銅綠假單胞菌(P.aeruginosa，MH368491.1)、惡臭假單胞菌(P.putida，AB681323.1)和熒光假單胞菌(P.fluorescens，MG576181.1)的16S rRNA基因序列，與銅綠假單胞菌標準菌株CGMCC1.10274及被GB 8538.57—2016、VITEK 2 Compact及API 20E這3種方法都鑒定為銅綠假單胞菌和可疑銅綠假單胞菌菌株的序列，用Clustal X和TreeViewX生物學(xué)軟件進行序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GB 8538.57—2016飲用天然礦泉水檢驗銅綠假單胞菌結(jié)果

按照GB 8538.57—2016標準，CN培養(yǎng)基上只有藍/綠色菌落不需要做乙酰胺肉湯確證性實驗，其他的產(chǎn)熒光(非藍/綠)菌落以及紅褐色菌落都需要做乙酰胺肉湯確證性實驗，由此可見乙酰胺肉湯實驗是銅綠假單胞菌鑒定的一個重要生化指標。為了防止實驗過程中所產(chǎn)氨的揮發(fā)對實驗結(jié)果的影響，實驗選取環(huán)凱(培養(yǎng)基裝在無蓋的安瓿瓶中培養(yǎng))和陸橋(培養(yǎng)基裝在帶蓋的西林瓶中培養(yǎng))2個廠家的乙酰胺肉湯進行試驗比較，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，2個廠家的實驗結(jié)果完全一致，表明這25株野生型菌株不存在由于微弱產(chǎn)氨，通過無蓋的安瓿瓶揮發(fā)到空氣中，造成假陰性的結(jié)果。根據(jù)GB 8538.57—2016可以判定25株野生型菌株中，14株淺黃色產(chǎn)熒光乙酰胺肉湯陽性的菌株被鑒定為銅綠假單胞菌。

表1 GB 8538.57—2016鑒定結(jié)果

注：“+”為陽性結(jié)果;“-”為陰性結(jié)果。

2.2 VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果

標準菌株及25株野生型菌株VITEK 2 Compact生化鑒定結(jié)果見表2。由表2可知，19株菌株被鑒定為銅綠假單胞菌，其中YS-463、YS-535、YS-923、YS-1066、YS-1498這5株菌株雖然乙酰胺肉湯實驗為陰性，但卻被鑒定為銅綠假單胞菌，與按照GB 8538.57—2016檢驗方法鑒定的結(jié)果不一致。

2.3 API 20E生化鑒定結(jié)果

標準菌株及25株野生型菌株API 20E鑒定結(jié)果見表2。由表2可見，13株被鑒定為銅綠假單胞菌的野生型菌株，與GB 8538.57—2016檢驗方法及VITEK生化鑒定的結(jié)果一致；YS-463、YS-535、 YS-923、YS-1066、YS-1498這5株野生型菌株被鑒定為熒光假單胞菌，與GB 8538.57—2016檢驗方法判定結(jié)果一致，但VITEK2 Compact卻鑒定為銅綠假單胞菌；YS-686被鑒定為惡臭假單胞菌，但GB 8538.57—2016及VITEK2 Compact卻鑒定為銅綠假單胞菌。

表2 VITEK 2 Compact及API 20E鑒定結(jié)果

注：“+”為銅綠假單胞菌;“-f”為熒光假單胞菌;“-p”為惡臭假單胞菌;“-s”為少動鞘氨醇單胞菌;“-ab”為鮑氏不動桿菌;“-ah”為溶血不動桿菌。

2.4 16S rRNA PCR擴增

16S rRNA PCR擴增結(jié)果見圖1。由圖1可知，片段約為1 450 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 銅綠假單胞菌和可疑銅綠假單胞菌的 毛細管凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Capillary gel electrophoresis of P. aeruginosaand suspected P. aeruginosa strains

2.5 16S rRNA基因序列比對結(jié)果

將3種方法都鑒定為銅綠假單胞菌的13株菌株、3種方法鑒定結(jié)果不一致的6株可疑菌株和標準菌株CGMCC1.10274的16S rRNA基因序列經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫上BLAST程序同源性比較，結(jié)果與API 20E鑒定結(jié)果一致，證實只有13株為銅綠假單胞菌。通過比對序列發(fā)現(xiàn)可疑菌株YS-463、YS-535、YS-923、YS-1066、YS-1498和MG576181.1熒光假單胞菌序列基本一致，YS-686和AB681323.1惡臭假單胞菌序列基本一致，其余菌株和銅綠假單胞菌CGMCC1.10274的基因序列基本一致，結(jié)合細菌16S rRNA的9個可變區(qū)，發(fā)現(xiàn)序列之間的差異正好落在可變區(qū)內(nèi)，如圖2所示。通過系統(tǒng)發(fā)育樹圖3，也可以看出13株野生型銅綠假單胞菌與標準菌株CGMCC1.10274聚在一起，YS-463、YS-535、YS-923、YS-1066、YS-1498 5株菌株與熒光假單胞菌(MG576181.1) 聚為一類，而YS-686與惡臭假單胞菌(NBRC 100988)聚為一類。

圖2 16S rRNA基因序列差異Fig.2 The difference of 16S rRNA sequence

圖3 基于16S rRNA基因序列的銅綠假單胞菌和 可疑銅綠假單胞菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence ofP. aeruginosa and suspected P. aeruginosa strains

3 討論

由于物種間高度的保守性，16S rRNA基因序列被稱為“細菌化石”，目前已被廣泛應(yīng)用于遺傳進化分子水平上對細菌進行鑒定[12-14]。本文中其他3種方法與16S rRNA基因序列比對結(jié)果相比，GB 8538.57—2016鑒定結(jié)果中，1株為假陽性菌株，所占比例為7.14%；VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果中，6株為假陽性菌株，所占比例為31.58%；API 20E鑒定結(jié)果與16S rRNA基因序列比對鑒定結(jié)果一致，表明API 20E對銅綠假單胞菌的鑒定結(jié)果是準確和可靠的。

GB 8538.57—2016中對銅綠假單胞菌的進一步確認主要通過乙酰胺試驗，銅綠假單胞菌具有乙酰胺酶，能夠分解乙酰胺產(chǎn)氨。但已有研究顯示糞鏈球菌、洋蔥假單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌的部分菌株也具有乙酰胺酶，產(chǎn)氨試驗也為陽性[15]，于是造成了一些假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，如本文中的YS-686菌株。

VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)以方便、快捷、準確率高著稱，是絕大多數(shù)微生物實驗室、微生物工作者以及國家標準都認可的儀器，甚至以此儀器作為微生物鑒定是否準確的判斷依據(jù)，但陳冠武等[16]在檢測化妝品中銅綠假單胞菌時發(fā)現(xiàn)一株假陽性菌株，在本研究中也發(fā)現(xiàn)假陽性菌株，所占比例達31.58%。這可能與VITEK 2 Compact屬于表型鑒定有關(guān)，接種物的濃度，培養(yǎng)液的組分、孵育時間，細菌本身的一些不典型性以及儀器光學(xué)讀數(shù)頭等其他一些因素都會影響最終生化鑒定結(jié)果[17-18]。此外，本次試驗所選可疑菌落中淺黃色發(fā)熒光居多，與假單胞屬中常見黃色、發(fā)熒光的熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌易互相干擾，導(dǎo)致本次鑒定假陽性所占比例較高。

4 結(jié)論

GB 8538.57—2016雖是目前基層食品檢驗檢測機構(gòu)鑒定銅綠假單胞菌的首選方法，但對檢驗人員的技術(shù)要求較高，存在一定的主觀性；VITEK 2 Compact操作簡便、耗時短，但儀器和耗材昂貴；更重要的是2種方法對銅綠假單胞菌的鑒定可能受到惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌的干擾，有造成錯判的可能性。API 20E和16S rRNA基因序列分析法操作簡單、準確率高，但是API 20E耗時長，16S rRNA基因序列分析法試劑昂貴，對檢驗人員的分子生物學(xué)水平有一定的要求。綜上所述，銅綠假單胞菌的鑒定在采用GB 8538.57—2016方法的基礎(chǔ)上還需根據(jù)實驗室自身實際情況，結(jié)合VITEK 2 Compact、API 20E、16S rRNA基因序列分析法，互為佐證，提高準確率，減少誤判。