沈瑞華，郭軍玲，周哲敏

(1.江蘇昌九農(nóng)科化工有限公司,江蘇 南通 226413；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

腈水合酶(nitrile hydratase，NHase，EC 4.2.1.84)是一種由α亞基和β亞基組成的金屬酶[1]，根據(jù)其活性中心螯合的金屬離子不同，可將NHase分為鐵型NHase(Fe-NHase)[2]和鈷型NHase(Co-NHase)[3]。NHase主要來源于紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、諾卡氏菌屬(Nocardia)等原核生物，在植物病原菌和放線菌中也有發(fā)現(xiàn)[4]，真核生物鄰鞭毛蟲(Monosigabrevicollis)中也有NHase的發(fā)現(xiàn)[5]。隨著測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)的發(fā)展，更多來源的NHase將被挖掘并深入研究，研究各種來源NHase的基因類型也對(duì)NHase的改造具有重要意義。

腈是帶有—C≡N作為官能團(tuán)的有機(jī)分子，通常對(duì)活生物體有毒。NHase作用于腈類物質(zhì)的碳氮三鍵，催化腈類物質(zhì)水合生成相應(yīng)的酰胺類物質(zhì)(圖1)。晶體結(jié)構(gòu)顯示，不論是Fe-NHase還是Co-Nhase，金屬離子作為構(gòu)成催化中心的必要成分位于α亞基的活性中心內(nèi)，且活性中心位于α和β亞基的交界面，活性位點(diǎn)含有高度保守的氨基酸序列(Cys-X-X-Cys-Ser-Cys)，形成“爪狀”結(jié)構(gòu)，結(jié)合金屬離子形成活性中心，其中2個(gè)半胱氨酸(在Ser兩側(cè))的巰基被氧化成次磺酸和亞磺酸，形成Cys—SOH和Cys—SOOH[6-7]。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，基于計(jì)算機(jī)輔助的酶分子改造已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，不依賴于晶體結(jié)構(gòu)的蛋白同源建模、分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)極大地促進(jìn)了對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，Cheng等[8]基于量子力學(xué)/分子動(dòng)力學(xué)(QM/MM)算法，完成了NHase活性中心爪狀金屬配位結(jié)構(gòu)的計(jì)算模擬(圖2(a))，建立了NHase活性中心的力場(chǎng)參數(shù)文件，并基于此構(gòu)建了可信度極高的NHase模擬結(jié)構(gòu)(圖2(b))。值得注意的是，正確的金屬配位結(jié)構(gòu)和半胱氨酸氧化對(duì)NHase活性至關(guān)重要，相關(guān)位點(diǎn)的突變會(huì)影響NHase的酶活和穩(wěn)定性，甚至導(dǎo)致其失活，因此對(duì)NHase進(jìn)行改造時(shí)要盡量避免影響NHase的活性中心。

圖1 NHase催化的水合反應(yīng)Fig.1 Catalysis reaction of NHase

圖2 NHase的同源建模Fig.2 Homology modeling structure of NHase

圖3 NHase的翻譯后成熟機(jī)制Fig.3 Post-translational maturation mechanisms of NHase

在原核來源的NHase中，α亞基和β亞基的結(jié)構(gòu)基因下游通常具有一個(gè)開放閱讀框(ORF)，其編碼的蛋白產(chǎn)物被稱為調(diào)控蛋白，協(xié)助NHase獲取金屬離子，完成翻譯后修飾，對(duì)于NHase的成熟十分重要[9]。Fe-NHase和Co-NHase的調(diào)控蛋白在分子量大小及序列相似性上有著明顯差異[10-11]。目前認(rèn)為Fe-NHase的調(diào)控蛋白作為金屬伴隨子，主要參與鐵離子的運(yùn)輸，其分子量大約為4.7×104，并且具有一段保守基因序列CXCC，可能構(gòu)成金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于該基序中3個(gè)保守的半胱氨酸殘基進(jìn)行突變，將影響Fe-NHase的正常表達(dá)[10]。而Co-NHase的調(diào)控蛋白大約為1.4×104，目前沒有發(fā)現(xiàn)保守的金屬結(jié)合基因序列[12]，這種調(diào)控蛋白在NHase成熟過程中不僅能作為亞基交換伴隨子參與金屬傳遞，而且在亞基融合型NHase里也可直接發(fā)揮金屬伴隨子的功能來激活NHase(圖3)。Zhou等[13]對(duì)來源于RhodococcusrhodochrousJ1的Co-NHase研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，這種NHase的成熟，遵循一種“亞基自身交換”機(jī)制，調(diào)控蛋白作為亞基交換伴隨子協(xié)助NHase的α亞基獲取鈷離子并激活NHase(圖3(a))。Xia等[14]在對(duì)來源于Psedomonasputida的Co-NHase進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，亞基融合后的NHase不能發(fā)生亞基自身交換，但調(diào)控蛋白仍可作為金屬伴隨子激活NHase(圖3(b))。此外，也有報(bào)道來源于ComamonastestosteroniNi1的Fe-NHase和來源于真核生物M.brevicollis的Co-NHase的成熟則不需要調(diào)控蛋白，其成熟機(jī)制有待進(jìn)一步研究[15]。

圖4 提出的腈水合酶催化機(jī)制Fig.4 Proposed catalytic mechanisms of NHase

盡管越來越多的腈水合酶晶體結(jié)構(gòu)得到解析，并對(duì)其催化機(jī)制進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和計(jì)算研究，但其催化機(jī)制至今仍存在爭(zhēng)議。Hopmann團(tuán)隊(duì)參與NHase催化機(jī)制研究多年，目前已提出且被人們接受的催化機(jī)制有3種：第一種稱為內(nèi)球機(jī)制(inner-sphere mechanism)，腈類底物與活性中心的金屬離子直接配位，底物的氰基碳原子受到周圍的1個(gè)水分子的親核攻擊[16]，產(chǎn)生了一種與金屬成鍵的過渡中間態(tài)，然后釋放酰胺產(chǎn)物,X線晶體學(xué)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供了支撐[17](圖4(a))。第二種稱為外球機(jī)制(outer-sphere mechanism)，活性中心的水分子結(jié)合到金屬離子，然后進(jìn)行去質(zhì)子化(形成OH-)，并與活性中心的金屬離子配位，從而對(duì)附近的腈分子進(jìn)行親核攻擊[18]，氫原子與金屬成鍵形成過渡態(tài)后重排，最終形成酰胺類產(chǎn)物(圖4(b))；第三種為次外球機(jī)制(second-outer sphere mechanism)，與金屬離子結(jié)合的OH-引起另一水分子的去質(zhì)子化，新生成的氫氧根催化底物腈的水解，最終生成酰胺類產(chǎn)物[19](圖4(c))。近年來，使用先進(jìn)的計(jì)算方法和實(shí)驗(yàn)方法研究了腈水合酶催化腈水合的催化機(jī)制。例如，Vahe-Bandarian研究團(tuán)隊(duì)的Nelp等[7]用同位素示蹤法證明產(chǎn)物酰胺中的氧原子來源于腈水合酶的氨基酸中的氧原子； MacDonald等[20]使用量子力學(xué)/分子力學(xué)模型研究NHase催化機(jī)制，探索了腈水合酶的完整催化機(jī)制，涉及半胱氨酸-亞磺酸作為親核試劑，激活水分子以攻擊腈底物，中間體經(jīng)歷互變異構(gòu)以形成酰胺產(chǎn)物。這些工作并非主要用于確定哪種機(jī)制最可行，而是確定腈水合是否存在多種催化機(jī)制，為將來全面揭示NHase的催化機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 腈水合酶的應(yīng)用及存在缺點(diǎn)

腈水合酶的生物催化已迅速發(fā)展，在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域處于前沿，不僅在傳統(tǒng)酰胺類物質(zhì)的生產(chǎn)中，而且廣泛應(yīng)用在農(nóng)藥降解[21]、環(huán)境保護(hù)[22]等領(lǐng)域。在工業(yè)生產(chǎn)中，NHase主要應(yīng)用于高純度煙酰胺和丙烯酰胺的生產(chǎn)。

煙酰胺，也叫尼克酰胺，屬于B族維生素，在醫(yī)藥領(lǐng)域中用來預(yù)防糙皮病，也用來作為食品和飼料添加劑，近年來亦作為護(hù)膚品原料廣泛應(yīng)用在美容行業(yè)。丙烯酰胺是一種重要的基礎(chǔ)化工原料，在造紙(增強(qiáng)劑)、污水處理(凝素劑)、裝潢(原料)以及石油開采(降阻劑)等方面發(fā)揮著重要作用。丙烯酰胺的酶法生產(chǎn)是綠色生物催化法代替化學(xué)合成法的典型案例，具有諸多優(yōu)勢(shì)如：工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、能耗低、“三廢”少等。然而，大多數(shù)具有高活性的NHase在工業(yè)應(yīng)用中穩(wěn)定性較差，需嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度，例如，來源于PseudomonaschlororaphilsB23、RhodococcusrhodochrousJ1、Rhodococcussp.N-774的NHase僅在20 ℃以下穩(wěn)定[23-25]。

對(duì)于大多數(shù)工業(yè)酶，反應(yīng)速度將隨著催化溫度增加而顯著提高，但是酶在較高溫度下會(huì)因構(gòu)象變化而破壞蛋白結(jié)構(gòu)，影響酶活甚至導(dǎo)致失活[26]。NHase在工業(yè)應(yīng)用過程中普遍存在熱穩(wěn)定性差的問題，而腈類的水合過程屬于放熱反應(yīng)，所以在工業(yè)催化過程中，需要用冷凝水來降低反應(yīng)溫度，從而造成能源浪費(fèi)；另外，腈水合酶的不穩(wěn)定還體現(xiàn)在對(duì)底物(腈類有機(jī)物)和產(chǎn)物(酰胺類有機(jī)物)的耐受性差，容易使腈水合酶失活，產(chǎn)物丙烯酰胺只能維持較低的水平，給后續(xù)的丙烯酰胺濃縮工藝帶來影響。隨著市場(chǎng)的不斷拓展，酰胺類化合物的需求也日益劇增[27]，因此，如何提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性及產(chǎn)物耐受性已成為研究重點(diǎn)。

2 提高腈水合酶穩(wěn)定性的分子改造策略

通常來說，獲得高穩(wěn)定性NHase的方法主要有篩選自然界中天然存在的高穩(wěn)定性NHase和改造現(xiàn)有的NHase。挖掘新酶具有重要意義，不僅有可能篩選出耐高溫耐有機(jī)溶劑的新型NHase，還能為研究者們改造現(xiàn)有酶提供新的方向。挖掘嗜熱微生物來源的NHase以及對(duì)于腈水合酶進(jìn)行體外定向進(jìn)化同樣能夠篩選穩(wěn)定性提升的突變體，有望未來能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)菌株的更新?lián)Q代。

近年來，多種分子改造策略已被用于提高NHase的穩(wěn)定性，例如增設(shè)鹽橋[28]、降低自由能[29]、同源片段交換[30]、基因融合[31]等。此外，在酶結(jié)構(gòu)改造中，基于B因子的定點(diǎn)突變及半理性設(shè)計(jì)同樣是提升熱穩(wěn)定的有效策略，利用B因子開發(fā)所謂的B-FIT定向進(jìn)化方法以提高酶在有機(jī)化學(xué)和生物制造中的熱穩(wěn)定性[32]，可以將該技術(shù)應(yīng)用于提高NHase的穩(wěn)定性。如在提高NHase穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上再利用自動(dòng)誘導(dǎo)分批補(bǔ)料策略[33]、細(xì)胞固定化[34-35]等策略可進(jìn)一步拓展其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本文中，筆者總結(jié)了提高NHase穩(wěn)定性的分子改造策略，為工業(yè)用酶的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

2.1 增設(shè)鹽橋相互作用

嗜熱微生物由于能在高溫溫泉及火山口附近的高熱環(huán)境下生長(zhǎng)而引起人們的極大關(guān)注，嗜熱微生物來源的酶普遍具有較高的穩(wěn)定性，通常能在高溫下保持較高的催化活性。為了調(diào)查影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素，Yokot等[36]比較分析了47對(duì)嗜熱蛋白和嗜溫蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗜熱蛋白比嗜溫蛋白含有更多極性氨基酸殘基并形成鹽橋。例如，超嗜熱古細(xì)菌Pseudomonasfuriosus中的谷氨酸脫氫酶中，每10個(gè)氨基酸殘基有1.1個(gè)鹽橋，而嗜溫細(xì)菌Clostridiumsymbisun中的谷氨酸脫氫酶每10個(gè)氨基酸殘基只有0.6個(gè)鹽橋[37]。而且，隨著總鹽橋的增加及鹽橋網(wǎng)絡(luò)的比例提升，蛋白的耐熱性明顯增強(qiáng)，表明鹽橋是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的直接因素之一[38]。因此，將鹽橋相互作用引入目標(biāo)酶是一種提高穩(wěn)定性的有效策略。

Liu等[39]分析了來源于Pesudonocardiathermophila中的NHase和Bacillusthermophilic中的NHase晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)鹽橋在增強(qiáng)NHase穩(wěn)定性中有重要作用，他們研究了在熱力學(xué)作用下形成鹽橋的氨基酸側(cè)鏈區(qū)域結(jié)構(gòu)的柔性，涉及天冬氨酸、精氨酸和谷氨酸等氨基酸殘基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞基間的鹽橋作用減少了整個(gè)蛋白質(zhì)的波動(dòng)，有利于酶穩(wěn)定性的提高。Chen等[28]在來源于RhodococcusruberTH的NHase中確定了增加鹽橋的合適區(qū)域和類型，通過計(jì)算來源于P.thermophila的NHase和B.thermophilic的NHase的均方根漲落(RMSF)值，確定了3個(gè)易于變形的熱敏感區(qū)域(A1、A2和A3)，將穩(wěn)定的鹽橋相互作用引入R.ruberTH中的NHase的相應(yīng)區(qū)域，構(gòu)建了3個(gè)突變體：NHase-TH-A1、NHase-TH-A2和 NHase-TH-A3。其中，突變體NHase-TH-A3的熱穩(wěn)定性提高了160%，產(chǎn)物耐受性提高了7%，對(duì)超聲破碎的抵抗力提高了75%，同時(shí)酶活也有一定的提升。分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬顯示，具有中等均方根偏差(RMSD)值的NHase-TH-A3在亞基內(nèi)部和亞基界面中均增加了10個(gè)新的鹽橋(表1)，從而證實(shí)了增設(shè)鹽橋是增強(qiáng)酶穩(wěn)定性的有效策略。由此可見，增設(shè)鹽橋是增強(qiáng)酶的活性和穩(wěn)定性的有效的蛋白質(zhì)工程策略。

2.2 基于降低自由能構(gòu)建突變體庫(kù)

近年來，許多成功的例子已經(jīng)證明定向進(jìn)化是一個(gè)非常有效的改造方法，并且這種策略的設(shè)計(jì)并不高度依賴蛋白-功能的相互關(guān)系[40-41]，無需了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過模擬自然進(jìn)化、易錯(cuò)PCR或者化學(xué)及物理誘變等方法在體外改造酶的基因，進(jìn)而改造酶學(xué)性質(zhì)(包括熱穩(wěn)定性，底物范圍和對(duì)映選擇性等)。然而定向進(jìn)化會(huì)出現(xiàn)大量的突變體，最終目標(biāo)酶的篩選耗時(shí)耗力，因此，此方法的成功依賴高通量篩選方法的建立[42-43]。

與定向進(jìn)化相比，基于結(jié)構(gòu)解析的定點(diǎn)突變策略對(duì)提高酶的性能更加高效。隨著酶學(xué)研究的進(jìn)展，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系逐漸被闡明，基于對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系的分析，人們開始通過計(jì)算生物學(xué)手段預(yù)測(cè)可能降低酶分子自由能位點(diǎn)，縮小了突變庫(kù)，極大地減少了工作量，提高了酶穩(wěn)定性的改造效率。通常來說，通過使用計(jì)算機(jī)模擬軟件對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行同源建模，基于模擬結(jié)構(gòu)解析，分析影響酶自由能的結(jié)構(gòu)，再通過定點(diǎn)突變、迭代突變等手段改造酶的結(jié)構(gòu)，可有效提高酶熱的穩(wěn)定性。Xia等[29]借助Rosetta計(jì)算折疊自由能ΔΔG(圖5)，得到了234個(gè)單點(diǎn)突變候選對(duì)象，并結(jié)合RMSF結(jié)果，最終構(gòu)建了一個(gè)小的突變體庫(kù)(17個(gè)突變體)，篩選到穩(wěn)定性和催化性能都提高的突變體。其中，3個(gè)突變體β-M150C、β-T173Y和β-S189E在50 ℃下，半衰期分別增加了32%、7%和107%，熔融溫度(Tm)從原始酶的54.5 ℃分別提高到56.2、55.0和57.6 ℃，NHase的熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。此外，3個(gè)突變體的kcat/Km值比原始酶分別提高1.1倍、1.5倍和2.2倍。這項(xiàng)研究說明，基于對(duì)結(jié)構(gòu)的解析通過降低自由能來提高酶的穩(wěn)定性更加高效和理性。

表1 突變體中的鹽橋變化

突變體和野生型蛋白質(zhì)之間的ΔΔG=ΔG2-ΔG1圖5 蛋白質(zhì)的熱力循環(huán)Fig.5 Thermodynamic cycle of protein

2.3 同源片段交換

近年來，諸多蛋白質(zhì)工程方法被用來提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，其中同源重組方法是基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)化信息，將不同來源的同源蛋白質(zhì)片段整合到一個(gè)蛋白體，設(shè)計(jì)出高度變異但仍是天然折疊的嵌合蛋白[44]。通過構(gòu)建雜合蛋白突變體庫(kù)，可篩選得到穩(wěn)定性高的酶。

Cui等[30]通過計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行半理性設(shè)計(jì)，選擇來源于P.thermophilaJCM3095和Comamonastestosterone的NHase的相關(guān)片段，以P.putidaNRRL-18668的NHase的β亞基片段作為模板，通過同源片段交換提高了NHase的穩(wěn)定性，采用靶向氨基酸重組軟件(STAR)設(shè)計(jì)雜合NHase，并進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬以確定片段重組的交叉位點(diǎn)，最終構(gòu)建了7種雜合酶(圖6)，構(gòu)建的雜合NHase的熱穩(wěn)定性比原始酶提高了1.4至3.5倍，并顯示整個(gè)C端結(jié)構(gòu)域與NHase穩(wěn)定性有關(guān)。

通過交換NHase的相應(yīng)C端結(jié)構(gòu)域也可有效提高NHase的穩(wěn)定性，Sun等[45]將來自P.thermophila的熱敏性NHase(BpNHase)的C端替換為來源于P.thermophila的相對(duì)熱穩(wěn)定NHase(PtNHase)的C端，構(gòu)建了雜合NHase(SBpNHase)，與原始BpNHase的熔融溫度(Tm)為50 ℃相比，SBpNHase的Tm提高到55 ℃。此外，將Aurantimonasmanganoxydans來源NHase的β-6螺旋與來自P.thermophilaJCM3095的嗜熱NHase片段交換，變異體的熱穩(wěn)定性顯著提高，在40 ℃時(shí)的半衰期是野生型的2.4倍，并表明β亞基表面有一個(gè)額外的α-螺旋影響了該酶的穩(wěn)定性[46]。這些結(jié)果表明同源蛋白片段交換是一種提高酶穩(wěn)定性的有效方法。

圖6 雜合NHase的構(gòu)建Fig.6 Construction of the chimeric NHases

2.4 基因融合

在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)一般以多個(gè)亞基集聚體形式存在，集聚體形式對(duì)于生物活性的發(fā)揮有著重大意義。但亞基聚集是通過氨基酸之間的次級(jí)鍵作用形成，由于次級(jí)鍵的作用力較弱，蛋白質(zhì)容易受到環(huán)境的影響而出現(xiàn)解聚，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的性能。為了避免由于解聚而產(chǎn)生的影響，基因融合策略(技術(shù)處理兩個(gè)或多個(gè)基因融合成一個(gè)開放閱讀框)被應(yīng)用于解決酶穩(wěn)定性問題。

亞基融合可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性[47]，融合策略傾向于通過簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來優(yōu)化組裝[48]。NHase的亞基融合現(xiàn)象是在真核生物領(lǐng)鞭毛蟲Monosigabrevicollis的NHase中發(fā)現(xiàn)的，通過17個(gè)組氨酸連接將其α亞基和β亞基天然融合成一個(gè)單一肽鏈[5]。受這種NHase基因類型的啟發(fā)，Xia等[31]利用一段短肽將P.putida來源NHase的β亞基和α亞基進(jìn)行融合，構(gòu)建了單一肽的融合型NHase(圖7)，結(jié)果顯示該融合型NHase的酶活和穩(wěn)定性都得到了提高。

另外，自組裝肽是一類由于側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用而相互交聯(lián)的特殊多肽，將自組裝肽融合在蛋白質(zhì)末端，可強(qiáng)化多肽之間的聚集，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。Liu等[49]將P.putida來源的NHase與兩個(gè)自組裝肽(EAK16和ELK16)融合，結(jié)果顯著提高了NHase的穩(wěn)定性和產(chǎn)物耐受性。在50 ℃熱處理30 min后，與野生型NHase完全失活相比，β-亞基N末端融合EAK16的NHase和β-亞基C末端融合ELK16的NHase分別保留了45%和50%的活性；在10%丙烯酰胺的緩沖液中處理后，野生型NHase保留30%活性，而β-亞基N末端融合EAK16的NHase和β-亞基C末端融合ELK16 的NHase分別保留了52%和55%的活性。Chen等[50]在尿素誘導(dǎo)和熱激作用下對(duì)Rhodococcusruber進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，伴侶分子GroEL2，具有很高的熱穩(wěn)定性，并且可以穩(wěn)定其他蛋白質(zhì)。融合型NHase-GroEL2活性提高了63.6%，穩(wěn)定性評(píng)估表明，熱處理和丙烯酰胺(AM)浸泡后的殘留活性分別提高了2.9倍和1.1倍。這些穩(wěn)定性和產(chǎn)品耐受性顯著提高的融合性NHase有助于NHase的進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用。

圖7 融合型NHase的基因結(jié)構(gòu)Fig.7 Gene structure of the fusion NHase

3 總結(jié)與展望

NHase的廣泛應(yīng)用吸引了大批研究者在相關(guān)領(lǐng)域開展研究，如：腈水合酶的生物催化、微生物法高效綠色生產(chǎn)酰胺類物質(zhì)、生物代謝環(huán)境中腈從而保護(hù)環(huán)境，對(duì)改善人類生存環(huán)境和生活質(zhì)量有重要意義。在NHase的應(yīng)用中，主要是其低穩(wěn)定性和低耐受性限制NHase的工業(yè)應(yīng)用。本文中，筆者總結(jié)了近年來通過分子改造和蛋白質(zhì)工程等提高NHase穩(wěn)定性的方法，經(jīng)改造后的NHase具有更高的穩(wěn)定性。在過去的幾十年中，原核腈水合酶主要用于工業(yè)酰胺生產(chǎn)和腈的生物修復(fù)，將來有必要進(jìn)一步研究真核來源的腈水合酶并挖掘新的腈水合酶。隨著宏基因組學(xué)、蛋白質(zhì)工程、合成生物學(xué)和生物信息學(xué)等領(lǐng)域的飛速發(fā)展，更多來源NHase的發(fā)現(xiàn)、篩選和表征，NHase的生物合成機(jī)制、翻譯后合成機(jī)制及催化機(jī)制方面將取得更大的進(jìn)展。如果在不久的將來能夠克服NHase低耐受性和低穩(wěn)定性的局限性，則對(duì)該酶的研究有望進(jìn)一步發(fā)展，這種綠色催化劑的應(yīng)用也將更加廣泛。