周 明，李玉來，楊能安，李 建，陳小娟，胡 碩

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 PET中心，湖南 長沙 410008；2.湖南省腫瘤醫(yī)院 藥學(xué)部，湖南 長沙 410013)

氨基酸是腫瘤增殖過程的必需營養(yǎng)物質(zhì)，利用放射性核素標記氨基酸類似物作為顯像劑，對腫瘤進行特異性顯像是近些年的研究熱點[1-4]。由于氨基酸結(jié)構(gòu)的特殊性，用11C或18F直接標記產(chǎn)率低、穩(wěn)定性差[5]，而Al18F、68Ga、99mTc等都會對原有分子結(jié)構(gòu)有較大改變，容易導(dǎo)致標記分子的靶向性降低、毒性變大[6]。氟硼酸結(jié)構(gòu)是一種與α-氨基酸結(jié)構(gòu)極其類似的結(jié)構(gòu)，研究表明，用氟硼酸結(jié)構(gòu)取代α-氨基酸結(jié)構(gòu)后化合物的藥代行為與原來氨基酸非常相似，因此可以用氟硼酸類化合物代替氨基酸類化合物進行放射性標記用于腫瘤的顯像研究[7-9]。

目前18F標記氟硼酸類顯像劑主要采用氨基聚醚碳酸鉀溶液進行淋洗，通過固相萃取純化，產(chǎn)率較低，終末產(chǎn)品需要檢查氨基聚醚和乙腈等有害物質(zhì)的殘留[9]。本研究擬對現(xiàn)有的標記工藝進行部分優(yōu)化，以獲得更加安全、高效的放射性18F標記氟硼酸類顯像劑，并研究其在U87 MG細胞中的攝取情況，及在健康受試者體內(nèi)分布情況，為下一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 設(shè)備與材料

1.1 設(shè)備

PET/CT:美國GE Discover Elite；回旋加速器：美國GE Qilin；氟多功能藥物合成模塊：派特(北京)科技；Radio-TLC儀：美國 Bioscan公司；CRC-25R 型活度計：美國 Capintec公司；Radio-HPLC儀、分析型C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)：美國Agilent 公司；γ放射免疫分析儀：北京核海高技術(shù)有限公司。

1.2 材料

標記前體苯丙氟硼酸由陳小元教授和劉志博教授惠贈；氨基聚醚(kryptofix2.2.2, K2.2.2)/K2CO3溶液：派特(北京)科技；Sep-Park Light Al2O3柱、Sep-Park Light C18柱：美國Waters公司；Millex.GS無菌過濾器(0.22 μm)：美國Millipore公司；色譜純乙腈：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；18O-H2O：江蘇華益；U87 MG細胞：中南大學(xué)細胞實驗中心。

2 實驗方法

2.1 對照組苯丙氟硼酸常規(guī)標記方法

1)采用GE公司Qilin醫(yī)用質(zhì)子回旋加速器進行18O(p，n)18F反應(yīng)生成18F-，加速器束流為50 μA，轟擊時間為20 min；2)將步驟18F-經(jīng)管道傳輸至Sep-Park Light QMA上并被QMA捕獲；3)反應(yīng)管中加入0.2 mL濃度為500 mmol/L的苯丙氟硼酸乙醇溶液和0.2 mL pH為2.5的噠嗪-鹽酸緩沖液；4)用K2.2.2/K2CO3的混合溶液0.5 mL18F-淋洗至安瓿瓶中，并取100 μL加入到反應(yīng)瓶中；5)80 ℃條件下苯丙氟硼酸溶液與18F-進行核素交換反應(yīng)(如圖1);6)20 min后反應(yīng)體系加入去離子水5 mL進行淬滅反應(yīng)；7)淬滅反應(yīng)后的體系直接過Sep-Park Light C18柱純化，并用10 mL水清洗C18柱；8)用50%的乙醇溶液5 mL淋洗C18柱即得[18F]-苯丙氟硼酸溶液([18F]-Phe-BF3)。

圖1 [18F]-苯丙氟硼酸合成路線圖

2.2 實驗組苯丙氟硼酸標記方法

1)18F-生產(chǎn)與捕獲方式與實驗組相同，反應(yīng)管中加入0.2 mL濃度為500 mmol/L的苯丙氟硼酸乙醇溶液；2)用pH=2的鹽酸氯化鈉溶液0.5 mL將18F-淋洗至安瓿瓶中，并取100 μL加入到反應(yīng)瓶中；3)80 ℃條件下苯丙氟硼酸溶液與18F-進行同位素交換反應(yīng)；4)20 min后反應(yīng)體系加入5 mL去離子水進行淬滅反應(yīng)；5)淬滅反應(yīng)后的體系直接過Sep-Park Light Al2O3柱純化得產(chǎn)品溶液，比活度為(6.11±0.25)MBq/μmol。

2.3 [18F]-苯丙氟硼酸質(zhì)量控制

對產(chǎn)品溶液的理化性質(zhì)、放化純度、細菌、內(nèi)毒性等質(zhì)控指標進行測定(參考2015版藥典)。對比放射性產(chǎn)物[18F]-苯丙氟硼酸與反應(yīng)原料[19F]-苯丙氟硼酸(標準品)HPLC保留時間，確定放射性產(chǎn)物純度的流動相為0～2 min，5%乙腈；2～10 min，20%乙腈；10～15 min，100%乙腈。

2.4 細胞攝取實驗

為了確定顯像劑[18F]-苯丙氟硼酸是否與腫瘤細胞有靶向性，選用U87 MG人膠質(zhì)瘤細胞，分為三組，其中實驗組為[18F]Phe-BF3，阻斷組為[18F]-Phe-BF3+Phe-BF3，游離18F-為對照組。實驗組細胞經(jīng)PBS清洗三次，加入顯像劑[18F]-Phe-BF32.96 MBq，孵育1 h，再用PBS清洗三次后加0.5 mL 1 mol/L NaOH，最后收集細胞液測γ計數(shù)；阻斷組細胞經(jīng)PBS清洗三次，加入Phe-BF3(500 mg/L)，孵育0.5 h后，加顯像劑2.96 MBq，再孵育1 h，然后PBS清洗三次后，加0.5 mL 1 mol/L NaOH，收集細胞液測γ計數(shù)；對照組加游離18F-2.96 MBq，孵育1 h，PBS清洗三次后加0.5 mL 1 mol/L NaOH，最后收集細胞液測γ計數(shù)。各組保持最終體積一致。

2.5 PET顯像

2.5.1受試人群 共招募志愿者3人，其中男性1人，女性2人，年齡在56～60歲，中位年齡57歲，3人體檢無器質(zhì)性疾病。該項目已通過醫(yī)院倫理委員會批準(201601007)，檢查前告知受檢者并簽署知情同意書。

2.5.2顯像方法 受檢者仰臥于PET/CT檢查床，靜脈注射[18F]-苯丙氟硼酸4.44 MBq/kg后，分別于5、15、30、45、60、75、90 min，分別進行PET/CT靜態(tài)掃描，先進行CT掃描，掃描范圍及順序為腦部-盆腔，然后立即進行PET采集，采集范圍同CT，采集順序為盆腔-腦部，共8個床位，每個床位15.7 cm，每個床位間重疊3.7 cm，PET采集方法采用3D-TOF序列，CT掃描管電壓為120 kV、自動mAs、螺距為0.984∶1、矩陣512×512，PET矩陣256×256，CT及PET層厚均為3.75 mm。

2.5.3圖像重建和數(shù)據(jù)處理 PET圖像重建均用有序子集最大期望值迭代(OSEM)法，得到三維圖像及橫斷、冠狀、矢狀斷層圖像。將PET和CT圖像傳到GE AW 4.6后處理工作站，進行幀對幀圖像對位融合，在健康志愿者腦、肺、心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎實質(zhì)、膀胱、肌肉及骨髓等處分別勾畫感興趣區(qū)(ROI)的放射性攝取，取ROI區(qū)內(nèi)放射性計數(shù)平均值即平均標準攝取值(SUV)，所有ROI測量3次取平均值，計算SUV，根據(jù)公式SUV=病灶的放射性濃度(kBq/mL)/注射劑量(MBq)/體重(kg)，由AW 4.6后處理工作站完成。

3 實驗結(jié)果

3.1 質(zhì)量控制

1)理化性質(zhì)：各三批產(chǎn)品均為無色透明溶液，pH 均為6到7之間。2)K2.2.2殘留：對照組產(chǎn)品溶液中K2.2.2均大于50 mg/L。3)細菌內(nèi)毒素：參考2015版藥典進行細菌、內(nèi)毒素檢測，結(jié)果表明，細菌和內(nèi)毒素均未檢出。4)放化純度：實驗組產(chǎn)品溶液利用HPLC檢測純度，實驗結(jié)果表明產(chǎn)品化合物放化純度大于99%，無明顯雜質(zhì)峰(如圖2)。

3.2 放化產(chǎn)率對比

實驗組和對照組各實驗三次，結(jié)果對照組產(chǎn)率為(4.16±0.26)%，實驗組產(chǎn)率為(10.26±0.42)%(P=0.000 03)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，如表1所示。

圖2 [18F]-苯丙氟硼酸產(chǎn)品溶液放化純度HPLC圖譜

表1 [18F]苯丙氟硼酸產(chǎn)率比較

注：對照組和實驗組差異顯著，P<0.01

3.3 細胞攝取實驗

孵育1 h后，U87 MG人膠質(zhì)瘤細胞系[18F]-Phe-BF3計數(shù)率為：實驗組(9.6±1.5)/min-1，阻斷組(7.5±1.1)/min-1，游離18F對照組(4.4±0.9)/min-1。計算攝取值，實驗組與阻斷組(P=0.007)、實驗組與游離18F對照組(P=0.008)的差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

3.4 PET顯像

3名健康志愿者均成功完成顯像。注射顯像劑后隨訪至24 h(10個半衰期)，志愿者均未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。受試者注射顯像劑5、10、15、30、60、90 min后顯像，可見5 min時顯像劑在心、肝、脾、胰腺、骨髓等臟器濃聚，隨著時間延長，在心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎實質(zhì)及骨髓中攝取隨時間逐漸減低，至30 min后接近本底(圖4)。而[18F]苯丙氟硼酸在不同時相人體腦組織及肺組織中放射性攝取均很低(圖5)，表明該顯像劑在正常腦組織中本底低，有利于顯示高攝取的病灶，同時該顯像劑主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，在腎盂、輸尿管及膀胱中呈高攝取。

圖3 [18F]-苯丙氟硼酸細胞攝取實驗

圖4 [18F]-苯丙氟硼酸在人體動態(tài)PET顯像圖

a——PET image;b——CT image;c——PET/CT image; d——PET/CT whole-body image

4 討論

本研究首次嘗試在[19F]氟硼酸標記過程中，用鹽酸氯化鈉溶液洗脫18F-，既避免了為保證反應(yīng)濃度對反應(yīng)18F-的濃縮，也避免了將18F-傳輸至濃縮管再轉(zhuǎn)至反應(yīng)管過程中的損失；同時，采用鹽酸氯化鈉溶液作為淋洗18F-溶液，不僅可以很好的實現(xiàn)對18F-的淋洗，還保證反應(yīng)過程中的酸性要求。此外，鹽酸氯化鈉溶液作為18F-淋洗液，相比氨基聚醚碳酸鉀溶液明顯具有更高的安全性，反應(yīng)體系也無需額外純化步驟，經(jīng)簡單的直接稀釋過柱即可直接用于人體，安全系數(shù)高，而且產(chǎn)品無需檢查氨基聚醚和乙腈等有機物的殘留。

細胞攝取實驗結(jié)果中，加[19F]-苯丙氟硼酸作為抑制劑的實驗組與單純的[18F]-苯丙氟硼酸實驗組相比細胞攝取計數(shù)差別不是很大，原因有可能是[18F]-苯丙氟硼酸產(chǎn)品溶液中的[19F]-苯丙氟硼酸含量高，因為核素交換反應(yīng)一般產(chǎn)率都不高，而且反應(yīng)前體與產(chǎn)品因為結(jié)構(gòu)一樣也很難純化分離，產(chǎn)品[18F]-苯丙氟硼酸中含有的部分[19F]-苯丙氟硼酸已經(jīng)對細胞攝取產(chǎn)生了較強的抑制作用，再額外加入[19F]-苯丙氟硼酸作為抑制劑效果可能不太明顯。

通過健康志愿者18F-苯丙氟硼酸PET/CT連續(xù)顯像發(fā)現(xiàn)，該顯像劑在正常腦組織中所有采集時像中放射性攝取均很低，表明該顯像在正常腦組織中本底很低，而通過細胞攝取實驗發(fā)現(xiàn)U87 MG人膠質(zhì)瘤細胞能特異性攝取[18F]-苯丙氟硼酸，因此可以預(yù)見膠質(zhì)瘤將呈高的放射性攝取，而這將為臨床膠質(zhì)瘤診斷提供有力的影像學(xué)支持。同時，[18F]-苯丙氟硼酸在肺組織中分布較少，而在心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎實質(zhì)及骨髓中攝取隨時間逐步減低，至30 min后基本接近本底，說明注射顯像劑后30 min即可以開始顯像。[18F]-苯丙氟硼酸主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，因此檢查結(jié)束后大量飲水可以讓顯像劑盡快排出體外，減少人體所受輻射。人體動態(tài)顯像提示，該顯像劑能夠較快的進行代謝分布，并且全身實質(zhì)臟器攝取較低，主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，提示[18F]-苯丙氟硼酸未來用于臨床顯像時背景干擾小，很可能作為一種有效的新型顯像劑用于臨床研究。