王俞方 肖啟國 王智 周俊 鄭芳

葡萄膜炎是一類葡萄膜、視網(wǎng)膜和玻璃體發(fā)生的炎癥性疾病，嚴(yán)重者可致盲，以青壯年多發(fā)，致病機(jī)制更多與自身免疫功能紊亂和炎癥反應(yīng)異常有關(guān)[1]，眼組織發(fā)生不可逆損害。葡萄膜炎患者房水中T和B淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，單核吞噬系統(tǒng)和中性粒細(xì)胞的溶酶體功能亢進(jìn)，提示葡萄膜炎的發(fā)病涉及體內(nèi)免疫系統(tǒng)的激活[2]。葡萄膜炎患者中可檢測出抗葡萄膜抗體，病情嚴(yán)重者更加明顯。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide binding and oligomerization domain-like receptor，NLRP3)炎癥小體屬于模式識(shí)別受體，結(jié)構(gòu)上具有高度保守性，是由核心蛋白NLRP3、接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、效應(yīng)蛋白pro-Caspase-1構(gòu)成的復(fù)合體。已有研究表明[3-4]，部分葡萄膜炎(VKH、Behcet病)患者外周靜脈血中可見NLRP3表達(dá)，NLRP3 炎癥小體被超活化，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18生成增加；NLRP3基因突變小鼠自身炎癥反應(yīng)明顯減弱。表明NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于 NLRP3炎癥小體及下游因子在葡萄膜炎眼內(nèi)活體組織中的表達(dá)國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是細(xì)胞內(nèi)外代謝過程中產(chǎn)生的具有很高生物活性的含氧化合物總稱，主要通過與硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)反應(yīng)，從硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)中釋放，激活 NLRP3炎性小體。自身免疫性炎癥反應(yīng)是葡萄膜炎發(fā)生的核心要素，通過ROS信號(hào)通路激活NLRP3炎癥小體，從而引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。本研究旨在闡明自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis,AU)的發(fā)病機(jī)制，為尋求新的藥物治療靶點(diǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇健康2月齡Lewis大鼠共40只，雌雄不限，體質(zhì)量235～275(250±25)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、空載體轉(zhuǎn)染組(空載體組)和NLRP3-shRNA沉默組(沉默組)，每組各10只。主要試劑：NLRP3基因shRNA序列和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(Invitrogen公司)，慢病毒載體(Sigma公司)，NLRP3、IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(R&D公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒(Media Cybernetics公司)，NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18抗體(Media Cybernetics公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，cDNA 試劑盒(Promega公司)，PCR擴(kuò)增試劑盒(Applied Biosystems公司)，BCA蛋白提取試劑盒(Pierce公司)，NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18，TRX和TXNIP抗體(Sigma公司)。主要儀器：手術(shù)顯微鏡(Olympus公司)，PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司)，電泳儀(GE公司)。

1.2 構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性AU大鼠模型模型組、空載體組和沉默組構(gòu)建AU模型。首先將視網(wǎng)膜S抗原(HS-Ag P35)凍干粉配成4 g·L-1溶液，與等量完全弗氏佐劑(CFA)混合至膏狀乳劑；然后取0.1 mL混合乳化劑注射大鼠雙后足墊、雙后腿及背部皮下，1周后再次同法免疫1次。第2天將450 mg·L-1傷寒桿菌內(nèi)毒素0.5 μL于大鼠睫狀體平坦部進(jìn)針行玻璃體內(nèi)注射，成功建立AU大鼠模型，裂隙燈下觀察右眼眼前節(jié)炎癥反應(yīng)并量化評(píng)分。參照Caspi方法分為0～4分，評(píng)分越高，炎癥反應(yīng)越強(qiáng)。

1.3 NLRP3沉默技術(shù)由Invitrogen公司設(shè)計(jì)4對(duì)大鼠NLRP3基因shRNA序列，對(duì)應(yīng)構(gòu)建4種pcDNA6.2-GW/EmGFP-NLRP3-shRNA質(zhì)粒，篩選NLRP3基因干擾效率最高的質(zhì)粒，包含shRNA序列3條。隨后將干擾效率最好的shRNA序列構(gòu)建入pDONR221-EmGFP-NLRP3-shRNA重組穿梭質(zhì)粒，重組成慢病毒載體pLenti6.3-EmGFP-NLRP3-shRNA，進(jìn)一步包裝慢病毒，大鼠經(jīng)多次頸靜脈注射空載體或慢病毒載體，劑量為每只100×106TU，感染時(shí)間為72 h?？蛰d體組和沉默組隨機(jī)抽取1只大鼠處死，取視網(wǎng)膜組織行冰凍切片，檢測病毒轉(zhuǎn)染效率。

1.4 觀察指標(biāo)模型成功后10 d、13 d、16 d、19 d采集大鼠左眼房水，模型成功后12 d、20 d處死大鼠制備視網(wǎng)膜組織切片，分別采用ELISA、免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法檢測NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP的表達(dá)。

1.4.1 ELISA法測量所有大鼠房水中NLRP3、IL-1β和IL-18的表達(dá)大鼠房水采集：大鼠經(jīng)100 g·L-1水合氯醛5 mL和奧比卡因12.5 mg·kg-1(6 mL)麻醉后，手術(shù)顯微鏡下將針頭刺入左眼，房水自動(dòng)吸入毛細(xì)管，房水收集于無菌 EP 管中，-80 ℃ 冷凍保存。按照 ELISA 試劑盒步驟，酶標(biāo)儀測定各組大鼠房水中NLRP3、IL-1β和IL-18表達(dá)水平?？瞻卓准由锼鼗贵w稀釋液，36 ℃避光孵育30 min，然后各孔加入酶結(jié)合物，36 ℃避光、TMB顯色，檢測波長450 nm處的吸光度(A)值。

1.4.2 免疫組織化學(xué)法測量所有大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)制作視網(wǎng)膜石蠟切片，厚約 4.0 μm。常規(guī) HE 染色，封片，顯微鏡下觀察，炎癥反應(yīng)參照 Caspi 方法分為0～4分，其中0分為無炎性細(xì)胞浸潤，正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)；0.5分為少量細(xì)胞浸潤，視網(wǎng)膜損傷范圍<1/4；1分為視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)炎性細(xì)胞浸潤，損傷范圍≥1/4；2分為中度炎性細(xì)胞浸潤達(dá)外核層，損傷范圍≥1/4；3分為視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜上廣泛炎性細(xì)胞浸潤達(dá)內(nèi)界膜，損傷范圍≥1/4；4分為視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜上極重度炎性細(xì)胞浸潤，伴全層視網(wǎng)膜浸潤，損傷范圍≥1/4。

采用免疫組織化學(xué)SP 法染色，參照試劑盒說明步驟進(jìn)行，先后滴加兔抗大鼠NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18一抗(12500)過夜孵育，洗滌后加入生物素標(biāo)記二抗(1500)37 ℃避光孵育4 h，洗滌加入鏈親和素-過氧化物酶溶液，DAB顯色。結(jié)果采用半定量法，以細(xì)胞核或細(xì)胞漿黃染為陽性細(xì)胞，染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比分別賦值0～3分和0～5分，兩項(xiàng)乘積大于3分為陽性，小于3分為陰性。

1.4.3 PCR法測量所有組別大鼠中NLRP3 mRNA水平采用Trizol試劑提取各組大鼠視網(wǎng)膜組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入正向和反向引物以及SYBR后，實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增。NLRP3上游引物：5’-GTGCAGATCCTAGGTTTCTCTG -3’、下游引物：5’- CAGGATCTCATTCTCTTGG ATC-3’，大小為125 bp;內(nèi)參β-actin上游引物：5’- AGACCTTCAACACCCCAG-3’、下游引物：5’- CACGATTTCCCTCTCAGC-3’，大小為101 bp。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.4.4 Western blot測量各組大鼠NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP蛋白表達(dá)采用BCA蛋白提取試劑盒獲取各組大鼠視網(wǎng)膜組織總蛋白，與等體積2×SDS上樣緩沖液充分混勻水?。蝗?0 μL樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上；依次加入兔抗鼠NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP一抗(11500)過夜孵育，洗膜后加入HRP標(biāo)記二抗(1500)37 ℃避光孵育4 h，ECL顯影，結(jié)果以目標(biāo)蛋白與參照蛋白條帶比值表示各種蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)多組間計(jì)量資料作單因素ANOVA分析，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)量資料作重復(fù)測量的方差分析，多組間計(jì)數(shù)資料作χ2分割檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 模型鑒定各組大鼠均能存活至各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，飲食和體質(zhì)量基本相當(dāng)，模型組、空載體組和沉默組大鼠活動(dòng)量稍減少。裂隙燈下觀察眼前節(jié)炎癥反應(yīng)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，模型組[(3.3±0.4)分]、空載體組[(3.3±0.3)分]和沉默組[(3.4±0.4)分]的評(píng)分均顯著高于空白對(duì)照組[(0.3±0.1)分]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.326、12.562、14.528，均為P<0.001)；模型組、空載體組和沉默組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.562，P>0.05)。

2.2 ELISA檢測結(jié)果ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和空載體組造模成功后10 d、13 d、16 d、19 d大鼠房水中NLRP3、IL-1β和IL-18水平顯著高于沉默組，空白對(duì)照組最低(P<0.05)。見表1。

組別NLRP3/μg·L-110d13d16d19dIL-1β/μg·L-110d13d16d19dIL-18/μg·L-110d13d16d19d空白對(duì)照組1.3±0.31.5±0.31.6±0.41.4±0.33.5±0.63.6±0.73.7±0.83.5±0.53.1±0.93.2±0.83.3±0.93.1±0.6模型組9.6±2.510.2±2.612.5±2.912.8±3.234.5±6.939.7±9.344.5±11.245.2±12.331.2±6.736.9±7.241.2±8.542.3±8.8空載體組9.3±2.79.8±2.911.4±3.111.8±3.233.2±9.537.8±10.242.3±12.343.6±14.529.8±6.935.6±7.539.8±8.241.3±8.5沉默組5.5±2.16.4±2.57.9±2.88.3±2.420.5±7.426.8±9.333.5±13.435.6±13.915.6±5.918.9±6.523.5±7.725.6±8.2F值5.6396.9877.5237.85615.23616.32820.23517.52420.23625.63931.23535.639P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

2.3 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和空載體組造模成功后12 d和20 d大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18陽性表達(dá)率顯著高于沉默組，空白對(duì)照組最低(均為P<0.05)。見表2和圖1。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18陽性表達(dá)率 [例(%)]

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

2.4 各組PCR結(jié)果PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和空載體組大鼠造模成功后12 d和20 d視網(wǎng)膜中NLRP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于沉默組，空白對(duì)照組最低(均為P<0.05)。見表3。

表3 PCR法測量各組大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3 mRNA表達(dá)水平

組別12 d20 d空白對(duì)照組0.056±0.0120.075±0.022模型組0.452±0.1210.523±0.142空載體組0.433±0.1060.506±0.136沉默組0.256±0.0890.345±0.102F值123.235156.569P值0.0000.000

2.5 Western blot檢測結(jié)果Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和空載體組造模成功后12 d和20 d視網(wǎng)膜組織中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP相對(duì)表達(dá)水平顯著高于沉默組，空白對(duì)照組最低(P<0.05)。見圖2和圖3。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中各種蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖3 各組大鼠造模后不同時(shí)間視網(wǎng)膜組織中各種蛋白表達(dá)

3 討論

葡萄膜炎根據(jù)病因可分為感染性和非感染性兩類，非感染性更多見，主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。葡萄膜中含有豐富的血管結(jié)構(gòu)和色素組織，許多全身免疫疾病的介質(zhì)經(jīng)血液循環(huán)在此沉積，因此葡萄膜成為自身免疫性炎癥的好發(fā)部位[5]。人眼組織中含有大量的自身抗原，通常這些抗原不會(huì)誘發(fā)自身免疫反應(yīng)；病理情況下機(jī)體自身免疫耐受性被破壞，易導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。

該研究通過構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性AU大鼠模型，經(jīng)裂隙燈下觀察眼前節(jié)炎癥反應(yīng)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，模型組、空載體組和沉默組的評(píng)分均顯著高于空白對(duì)照組(均為P<0.05)，符合AU病理改變，此處觀察到沉默組的炎癥反應(yīng)與模型組接近，考慮沉默組只是針對(duì)單一途經(jīng)進(jìn)行干預(yù)，影響AU的發(fā)病機(jī)制可能更為復(fù)雜；此外，炎癥評(píng)分較為主觀，并不能反映客觀的炎癥強(qiáng)度。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組和空載體組造模成功后10 d、13 d、16 d、19 d，大鼠房水中NLRP3、IL-1β和IL-18水平均顯著高于沉默組，空白對(duì)照組最低(P<0.05)。ASC是相對(duì)分子質(zhì)量約22 000的接頭蛋白，由PYD和CARD組成，主要分布于人單核/巨噬細(xì)胞核，應(yīng)激時(shí)迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿，連接NLRP3和 pro-Caspase-1，促進(jìn) NLRP3炎癥小體激活[6]?；罨腘LRP3通過自身分子結(jié)構(gòu)上特定位點(diǎn)與ASC相結(jié)合，進(jìn)而借助CARD-CARD相互作用方式呈放大倍數(shù)激活pro-Caspase-1，其主要功能是將無活性的IL-1β 和IL-18前體物質(zhì)組裝成具有活性的成熟體，最終發(fā)揮對(duì)應(yīng)的炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)葡萄膜細(xì)胞的損傷和修復(fù)延遲[7-8]。

本研究免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和空載體組造模成功后12 d和20 d大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β和IL-18陽性表達(dá)率顯著高于沉默組，空白對(duì)照組最低(均為P<0.05)。在多種免疫反應(yīng)中，成熟的 IL-1β 是有效的促炎介質(zhì)，能將先天性免疫細(xì)胞招募至感染部位，調(diào)節(jié)獲得性免疫細(xì)胞。以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)，患者血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β水平顯著高于正常健康人群，健康志愿者關(guān)節(jié)滑液中僅可檢測到微量的IL-1[9-10]。成熟的 IL-18 能夠促進(jìn)γ干擾素(IFN-γ)生成，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞的殺傷活性，同時(shí)刺激Th1和Th2型免疫反應(yīng)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，玻璃體內(nèi)注射一定量IL-1，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管通透性增高，色素上皮細(xì)胞間緊密連接開放，導(dǎo)致眼內(nèi)血-視網(wǎng)膜屏障破壞，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性葡萄膜炎。而IL-1 抑制劑能夠抑制免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，改善實(shí)驗(yàn)性AU的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。

本研究中PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和空載體組造模成功后12 d和20 d大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3 mRNA水平顯著高于沉默組，空白對(duì)照組最低(均為P<0.05)。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和空載體組造模成功后12 d和20 d大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、IL-1β、IL-18、TRX和TXNIP相對(duì)表達(dá)水平顯著高于沉默組，空白對(duì)照組最低(均為P<0.05)。有研究發(fā)現(xiàn)，影響葡萄膜炎發(fā)生和發(fā)展的主要信號(hào)通路學(xué)說有P2X7受體、溶酶體和ROS依賴途徑三種，其中更多學(xué)者認(rèn)為ROS可能發(fā)揮主要作用[15]。ROS主要通過與TXNIP反應(yīng)，從TRX中釋放，激活 NLRP3炎性小體[16]。線粒體功能損傷后釋放ROS是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵信號(hào)[17]，細(xì)胞內(nèi)加入ROS抑制劑Trolox后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-1和IL-1β水平明顯下降[18]。TRX系統(tǒng)在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)以及信號(hào)通路方面發(fā)揮重要作用，TXNIP主要通過調(diào)控抗氧化TRX表達(dá)，時(shí)間依賴性與TRX解離，與NLRP3蛋白結(jié)合，完成炎癥小體的組裝活化[19]。細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的TXNIP可增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平[20]。

綜上所述，NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子表達(dá)上調(diào)可能參與了AU的發(fā)生，并介導(dǎo)ROS信號(hào)通路發(fā)揮作用。