張梓涵,蔡 鋮,李 恒,朱益源,高 健,陶婷婷,丁 超,*

(1.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院,江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210023; 2.長江師范學院生命科學與技術(shù)學院,重慶涪陵 408100; 3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所,省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室,江蘇南京 210014)

蘿卜作為一種好培育、成本低的經(jīng)濟作物,可以通過有效的加工利用可以提升附加值并增加農(nóng)民收入。中國的涪陵地區(qū)地理環(huán)境獨特,在當?shù)禺a(chǎn)出的常見紅心蘿卜有北雁紅心蘿卜、胭脂蘿卜、龍泉紅心蘿卜、紅心一號蘿卜等,均有心皮全紅的特性[1]。紅心蘿卜色素是一種天然色素,主要是天竺葵素葡萄糖苷衍生物[2]。紅心蘿卜提取出的色素含量高、質(zhì)量好[3-4],為市場提供了更為物美價廉的天然安全色素選擇,對紅心蘿卜色素提取利用可提高該農(nóng)產(chǎn)品附加值。

目前我國已采用多種技術(shù)提取紅心蘿卜色素,包括溶劑提取法、超聲波輔助提取法、超臨界CO2提取法等[5-6],但紅心蘿卜內(nèi)部色素分布規(guī)律尚不明確。通過色素分布研究可實現(xiàn)紅心蘿卜分部利用,實現(xiàn)組合收益。因此,本文對4種紅心蘿卜進行色素的提取和含量測定,研究其色素分布,有助于對紅心蘿卜不同部位色素的選擇性利用,并檢測色素的穩(wěn)定性和探究其抑菌特性,利于紅心蘿卜的生產(chǎn)工藝優(yōu)化和深加工。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北雁紅心蘿卜(重量300～450 g,最粗部位直徑4～6 cm)、胭脂蘿卜(重量200～350 g,最粗部位直徑4～5 cm)、龍泉紅心蘿卜(重量500～550 g,最粗部位直徑9～11 cm)、紅心一號蘿卜(重量200～350 g,最粗部位直徑4～5 cm) 重慶長江師范學院;大腸桿菌(CICC10254)、金黃色葡萄球菌(CICC21600) 本實驗室提供;甲醇 色譜純,ROE scientific inc.;檸檬酸、抗壞血酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、三氯化鐵、硫酸鋁、鹽酸、氯化鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;食鹽 未加碘精制鹽,氯化鈉含量≥98.50%，中鹽;蔗糖 太古。

TP-214電子天平 丹佛儀器(北京)有限公司;PHS-3CpH計 上海精密科學儀器有限公司;SB25-12DTDN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;SF-CJ-2A凈化工作臺、GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;TG16-WS高速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph;U-3900紫外可見分光光度計 日本日立。

1.2 實驗方法

1.2.1 色素的提取 隨機選取北雁紅心蘿卜、胭脂蘿卜、龍泉紅心蘿卜、紅心一號蘿卜,處理收集需測定色素的部分,準確稱取各部位待測樣品10.00 g于三角瓶中,立即加入60 mL 0.01% HCl的甲醇溶液,密閉。用超聲波輔助提取法,設(shè)置溫度30 ℃,時間40 min[5]。后進行過濾,收集濾液,濾渣進行二次提取,直到顏色幾乎接近無色,合并濾液。將濾液在45 ℃的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)完全后,用0.01%的HCl水溶液對蒸餾燒瓶進行沖洗,溶解壁內(nèi)全部色素后倒入離心瓶。濃縮液在4000 r/min下離心10 min,取上清液,因紅心蘿卜色素在弱酸(pH=6.0)條件下保色度好[4],用0.01%的HCl溶液定容到25 mL保存。后續(xù)的實驗均用0.01%的HCl溶液10倍稀釋作為各品種蘿卜色素測定液a。

1.2.2 色素分布

1.2.2.1 色素總含量 選取pH示差法更為精確地確定總色素含量。根據(jù)熊玥等[4]研究,可知蘿卜紅色素為天竺葵素的葡萄糖苷衍生物,結(jié)合Fuleki等[7]的方法進行改進。取40 mL測定液a,平均分成兩份,每份20 mL,分別用pH=1.0、pH=4.5的緩沖液定容至100 mL,靜置后在最大吸收波長530 nm處測定其吸光值,計算其色素含量并進行比較。

式中:C為色素含量(mg/g);A0和A1分別 pH=1.0、pH=4.5時色素在530 nm 處的吸光度;V為提取液總體積(mL);n 為稀釋倍數(shù);M為天竺葵素-3-槐二糖苷相對分子量(648.5);ε為消光系數(shù)(30200);m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.2.2 不同部位色素含量分布比較 選用紫外分光光度法測定,進行不同部位的比較,最大吸收波長為530 nm。蘿卜的根頭至葉柄部位為上部,根頸至根頭部位為中部,根頸至真根部位為下部,還選定了外皮和葉片的部分[8],向各部位稀釋后的測定液中加入0.10 mol/L pH3.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH并定容,測定紅心蘿卜在波長530 nm處的吸光度,并比較其差異。

1.2.3 色素穩(wěn)定性

1.2.3.1 光照穩(wěn)定性 取胭脂蘿卜色素提取液5 mL于三支試管中,分別于室溫避光、室溫24 h有光照、室溫自然光條件下放置總共144 h,在4、24、48、96和144 h時,測在波長530 nm處的吸光度,并觀察色素顏色的變化。

1.2.3.2 熱穩(wěn)定性 取五只試管,取5 mL胭脂蘿卜色素提取溶液,加入5 mL蒸餾水,分別設(shè)置在室溫(25 ℃)、40、60、80 ℃下進行實驗[9],放置避光2 h,每隔1 h測量其在530 nm處的吸光度,同時觀察色素顏色變化。

1.2.3.3 酸堿穩(wěn)定性 取5 mL胭脂蘿卜的色素提取液,用0.2 mol/L的HCl、0.1 mol/L的NaOH配制pH為3、5、7、9、11、13的緩沖液[9],準確移取5 mL緩沖液于色素提取液中,室溫下避光放置4 h,每隔2 h分別測定其在波長530 nm處的吸光度,同時觀察色素顏色變化。

1.2.3.4 金屬離子穩(wěn)定性 取5 mL胭脂蘿卜色素提取液,分別加入5 mL 0.001、0.002、0.003 mol/L的氯化鈣、三氯化鐵、氯化鋁以得到Al3+、Fe3+、Ca2+,另取一支加5 mL蒸餾水,室溫下放置12 h,最后分別測定其在530 nm處的吸光度,目測顏色變化。

1.2.3.5 氧化還原特性 取5 mL胭脂蘿卜色素提取液,分別加入5 mL濃度為1%、2%、3%的H2O2、Na2SO3溶液,另取一支加5 mL蒸餾水,室溫下避光放置2 h,測定其在530 nm的吸光度。

1.2.3.6 外源食品添加劑穩(wěn)定性 取5 mL胭脂蘿卜色素提取液,分別加入5 mL 0.003 mol/L的蔗糖、食鹽、檸檬酸和維生素C(抗壞血酸)溶液[10],另取一支加5 mL蒸餾水,室溫下避光放置12 h,分別測定其在530 nm處的吸光度。

1.2.4 色素的抑菌特性

1.2.4.1 抑菌特性探究 選用一種革蘭氏陰性菌和一種革蘭氏陽性菌進行試驗,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)經(jīng)培養(yǎng)增殖,取胭脂蘿卜色素測定液a,經(jīng)pH示差法計算濃度后,稀釋調(diào)整至3 mg/mL,作為胭脂蘿卜色素測定液b,用濾紙片法進行色素的抑菌性探究實驗[11],分別設(shè)置擴散組與非擴散組[12],擴散組在接種后在4 ℃冰箱內(nèi)放置24 h,使胭脂蘿卜色素測定液b充分擴散后再進行常規(guī)培養(yǎng),每組均設(shè)置無菌生理鹽水對照組。測量抑菌圈的大小,以此判定胭脂蘿卜色素的抑菌性能。

1.2.4.2 最小抑菌濃度(MIC) 取胭脂蘿卜色素測定液a與各菌液按比例加入試管中,使試管中的抑菌劑(即胭脂蘿卜色素)的質(zhì)量濃度梯度為50.00%、25.00%、12.50%、6.25%、3.13%、1.56%、0.78%、0.39%、0.19%、0.09%、0.05%和0,后在(37±1) ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng),在24 h后觀察比較,培養(yǎng)基中沒有細菌生長的最低濃度即為最小抑菌濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組條件下的實驗均設(shè)置對照實驗,每個樣品重復(fù)3次。通過PASW Statistics 18軟件進行T檢驗,并進行數(shù)據(jù)評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素分布

2.1.1 色素總含量比較 圖1以色素含量最小的北雁紅心蘿卜作為標準,比較了其余3種紅心蘿卜色素的含量,可以看出胭脂蘿卜色素含量顯著高于其他品種的蘿卜(P<0.05)。根據(jù)pH試差法得出胭脂蘿卜色素含量為0.039 mg/g。相較于其他果蔬,如紅莧菜花青素(0.035 mg/mL[13]),胭脂蘿卜的色素含量基本一致,但作為根莖類食用原料,單位面積產(chǎn)量高,因此蘿卜紅色素可以作為色素加工的重要原料。

圖1 四種紅心蘿卜的色素含量比值Fig.1 Pigment absorbance of differentparts of four kinds of red radish

2.1.2 不同部位色素含量分布比較 紫外分光光度法的結(jié)果(圖2)表明,每種蘿卜色素分布的差異性,北雁紅心蘿卜標準品底部色素含量顯著高于上部和中部,而龍泉紅心蘿卜是上部色素含量明顯高于中部和底部的色素含量。通過整體數(shù)據(jù)的差異顯著性分析可得,在測四種紅心蘿卜的外皮與其他部位吸光值的差值平均值是0.040,在紅心蘿卜這四個品種中,外皮的色素均為含量最高。葉中的紅色素含量普遍偏低,但提取葉中的紅色素能做到廢物利用,經(jīng)濟價值較高。

圖2 四種紅心蘿卜不同部位色素吸光值Fig.2 Ratio of pigment content of4 kinds of carrots in different parts

2.2 紅心蘿卜色素穩(wěn)定性

2.2.1 光照穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性 對144 h儲藏期內(nèi)色素的穩(wěn)定性進行監(jiān)測,圖3中可以看出,日光和燈光照射條件下,吸光值從24 h之后下降速度變快,避光條件下的色素在觀測期內(nèi)變化不大(吸光值變化在0.002之內(nèi))。在日光和燈光處理比較,日光條件下變動相對較大,日光處理的吸光值在48 h左右開始低于燈光處理的數(shù)據(jù)。但圖3看出,無論是日光還是燈光,在短時間內(nèi),對胭脂蘿卜色素的影響仍有限,吸光值最終變化范圍在0.04之內(nèi)。在24 h出現(xiàn)的燈光和日光條件下的吸光值短暫升高,推測是溶劑揮發(fā)導(dǎo)致。根據(jù)圖4可以看出在室溫至40 ℃之間,胭脂蘿卜色素較為穩(wěn)定,在60 ℃之后,色素吸光值出現(xiàn)更為明顯的下降,可見在室溫到40 ℃的溫度區(qū)間,色素對溫度變化并不敏感,對高溫較為敏感。

圖3 不同光照條件下的色素吸光值Fig.3 Pigment absorbance underdifferent light conditions

圖4 不同溫度下色素吸光值Fig.4 Pigment absorbance at different temperatures

2.2.2 pH穩(wěn)定性 在pH從3～13變動的同時,吸光值有明顯的變化(表1),與中性條件相比,色素在強酸(pH≤5)或強堿(pH≥11)條件下,尤其是在強酸性條件下吸光度值變動極大,可以推測是由于強酸和強堿破壞了色素的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致吸光度值的變化,所以胭脂蘿卜色素應(yīng)在中性環(huán)境(pH≈7)下使用。

表1 不同pH下的色素吸光值Table 1 Pigment absorbance at different pH values

2.2.3 金屬離子穩(wěn)定性 胭脂蘿卜提取液在不同金屬離子處理12 h后,各溶液的吸光度均有變化(表2)。肉眼觀察溶液顏色時,加Fe3+的溶液顏色由紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽丶t色,加Al3+后原紫紅色變得更為鮮艷,而Ca2+對胭脂蘿卜色素的影響是最小的。由此說明,胭脂蘿卜紅色素的抗Ca2+的干擾能力強,抗Fe3+、Al3+的干擾能力較弱,故在使用時應(yīng)注意減少暴露在Fe3+、Al3+金屬離子中,盡量避免使用鐵、鋁制容器儲藏。

表2 常見金屬離子處理后色素的吸光值Table 2 Pigment absorbance after common metal ion treatment

2.2.4 氧化劑和還原劑穩(wěn)定性 當胭脂蘿卜色素與H2O2共存時,吸光值最低值出現(xiàn)在濃度2%時的0.037±0.005,影響較大,在與Na2SO3共存時,吸光值在2%時為0.105±0.009,相比較之下,H2O2試劑處理下的吸光度明顯變化更大,與空白對照樣吸光度相差最大約為0.406。所以,可以推測胭脂蘿卜色素的耐還原能力比耐氧化能力強。

表3 氧化劑和還原劑處理后色素的吸光值Table 3 Pigment absorbance after treatmentwith oxidant and reducing agent

2.2.5 常見食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響 含有常見食品添加劑的溶液12 h后吸光度值變化程度不同(圖5),與空白組相比，食鹽對色素的影響不顯著,說明胭脂蘿卜色素對鹽的耐受度較大;而蔗糖相比于食鹽,對色素吸光值的影響幅度較為明顯,12 h后吸光值下降大于0.1,可見此色素對糖的耐受度偏低,因此在應(yīng)用此類色素時,需要關(guān)注多糖的添加。相反,檸檬酸和維生素C這類抗氧化劑,對色素有明顯的護色作用[14],可用作此色素的維穩(wěn)劑。

圖5 常見食品添加劑處理后色素的吸光值Fig.5 Pigment absorbance after treatmentof common food additives

2.3 抑菌特性

未擴散時胭脂蘿卜色素測定液對大腸桿菌的抑菌圈大小為(7.18±0.30) mm,而大腸桿菌在無菌的生理鹽水紙片下,抑菌圈大小僅有(4.12±0.12) mm。擴散后,胭脂蘿卜色素測定液和無菌生理鹽水處理大腸桿菌的抑菌圈大小都有增大,胭脂蘿卜色素測定液處理下抑菌圈由未經(jīng)擴散的(7.18±0.30) mm擴大為擴散后的(9.01±0.45) mm,說明擴散后抑菌效果更好;同時,擴散后胭脂蘿卜色素測定液處理下大腸桿菌的抑菌圈大小仍然大于無菌生理鹽水處理下大腸桿菌的抑菌圈大小(5.08±0.15) mm。對于金黃色葡萄球菌,抑菌圈的大小也有相同的規(guī)律,但是經(jīng)擴散和未經(jīng)擴散處理下,胭脂蘿卜色素測定液處理下的金黃色葡萄球菌抑菌圈比相同情況下的大腸桿菌抑菌圈小,說明胭脂蘿卜色素測定液對大腸桿菌的抑菌效果良好。綜合其他數(shù)據(jù)可以得出,胭脂蘿卜色素對常見的致病性細菌,如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌,均有不同程度的抑制效果,且經(jīng)擴散處理后的效果更為明顯。

最小抑菌濃度(MIC)實驗結(jié)果由表5所示,胭脂蘿卜色素在6.25%～50的質(zhì)量濃度之間時,對兩個菌種均有較為良好的抑菌效果,胭脂蘿卜色素對金黃色葡萄球菌的抑菌作用在3.13%～6.25%的質(zhì)量濃度之間開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)折,即在最小質(zhì)量濃度為6.25%時,胭脂蘿卜色素對金黃色葡萄球菌就有良好的抑菌效果,而對大腸桿菌的抑菌作用在1.56%～3.13%之間開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)折,即在最小質(zhì)量濃度為3.13%時對大腸桿菌就有良好的抑菌效果;對比看出相對金黃色葡萄球菌,胭脂蘿卜色素對大腸桿菌的抑菌效果更好,與抑菌圈實驗結(jié)果相似。

表4 胭脂蘿卜色素作用下培養(yǎng)皿中的抑菌圈(mm)Table 4 Bacteriostatic ring in petri dish under the action of red radish pigment(mm)

表5 最小抑菌濃度Table 5 Minimum inhibitory concentration

備注:“+”表示觀察到有微生物生長,“-”表示觀察到無微生物生長。在質(zhì)量濃度逐漸降低的過程中,培養(yǎng)液也愈加渾濁,胭脂蘿卜色素對大腸桿菌的抑菌作用從1.56%開始到0.19%呈現(xiàn)了逐漸減弱的狀態(tài),從0.19%開始與0差別較小,微生物生長情況幾乎未受影響;胭脂蘿卜色素對金黃色葡萄球菌的抑菌作用從3.13%開始到0.78%逐漸減弱,從0.39%開始與0差別較小。

3 結(jié)論

通過對北雁紅心蘿卜、胭脂蘿卜、龍泉紅心蘿卜、紅心一號蘿卜等4種蘿卜色素分析,發(fā)現(xiàn)胭脂蘿卜色素總量最高(0.039 mg/g),相比其他果蔬,色素含量具有較高的應(yīng)用價值。蘿卜個體內(nèi)部色素存在差異,蘿卜皮中的色素含量顯著高于蘿卜內(nèi)部其他部位(P<0.05)。提取色素對高溫(≥60 ℃)較為敏感,在pH=7時色素較穩(wěn)定,抗Fe3+、Al3+的干擾能力較弱;耐還原能力比耐氧化能力強;檸檬酸和維生素C對色素有保色作用,蔗糖和食鹽對色素穩(wěn)定性影響不顯著,且對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。食品加工和貯運過程中如何提高胭脂蘿卜色素穩(wěn)定性及工業(yè)化生產(chǎn)仍需進一步研究。