姜聲旺,沈清武

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128)

動物屠宰后,肌肉細胞以糖酵解的方式供能。糖酵解產(chǎn)生的乳酸和熱量導(dǎo)致pH下降,軀體溫度升高。高溫和低pH使蛋白質(zhì)變性,肌肉收縮,水分從細胞滲出,從而產(chǎn)生PSE(Pale,Soft,Exudative)肉,降低肉品質(zhì)[1-3]。PSE的高發(fā)生率給屠宰業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[4-6]。由此可見,減緩宰后糖酵解速度可有效控制PSE肉的發(fā)生,提高肉品質(zhì)。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是糖酵解的限速酶之一,催化糖酵解的最后一步反應(yīng),將磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基團轉(zhuǎn)移給二磷酸腺苷,生成丙酮酸和三磷酸腺苷[7-8]。有研究表明,PSE肌肉中的丙酮酸激酶可能發(fā)生了磷酸化或者乙?；揎?從而使得該肌肉中的丙酮酸激酶活性比正常肉中的要高,但具體機制尚不清楚[9-12]。

哺乳動物體內(nèi)有4種PK同工酶:PKL、PKR、PKM1和PKM2,PKL和PKR是由PKLR基因編碼的不同剪接體;PKM1和PKM2是由PKM基因編碼的不同剪接體[13-15]。這四種剪接體的表達具有組織特異性,其中PKL主要在肝臟和腎臟中表達;PKR主要在紅細胞中表達;PKM1主要在正常成年期尤其是肌肉組織中表達;而PKM2主要在胚胎發(fā)育期和腫瘤組織中表達[13-15]。小鼠PKM1和PKM2的差異在于PKM1含有外顯子9而不含外顯子10;PKM2含有外顯子10而不含外顯子9,二者之間共有22個氨基酸的差異[13-15]。慢病毒載體是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的,能把外源基因有效地整合到宿主染色體中并持久表達目的基因,具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、外源基因表達量高、表達穩(wěn)定等優(yōu)點[16-18]?！癎olden Gate”克隆法是在同一反應(yīng)體系中,利用ⅡS型限制性核酸內(nèi)切酶,在識別位點后面切開DNA,產(chǎn)生帶有粘性末端的DNA片段,同時用連接酶將幾個DNA片段按照特定的順序連接成無內(nèi)切酶識別位點的DNA片段,具有省時省力且不含酶切位點片段的優(yōu)點[19-20]。C2C12細胞是由Yaffe等[21]建立的小鼠成肌細胞株的亞克隆,在低血清條件下C2C12細胞被誘導(dǎo)分化成肌管,并表達myosin和myogenin等特征性蛋白。因此,C2C12細胞是研究成肌細胞增殖和分化的首選模型[22-25]。

本研究用“Golden Gate”克隆法構(gòu)建了小鼠PKM1基因慢病毒過表達載體,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PKM1基因的C2C12細胞株,為深入研究PKM1翻譯后修飾對其自身酶活及細胞糖酵解的影響提供了材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人胚胎腎上皮細胞293T、小鼠成肌細胞C2C12賽齊(上海)生物工程有限公司;pGEM-T載體系統(tǒng)(含JM109感受態(tài)細胞) 普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;pDown-3×FLAG-BsaI-ccdB-Cm-BsaI骨架載體、pLV.Des2d.C/EGFP:T2A:Puro骨架載體、病毒包裝質(zhì)粒Mix(pMDLG/pRRE、pCMV-VSVG、pRSV-Rev) 賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司;Stbl3感受態(tài)細胞 廣州復(fù)能基因有限公司;動物組織總RNA提取試劑盒、TIANScript II cDNA第一鏈合成試劑盒、溴化乙錠(EB)溶液、6×DNA上樣緩沖液、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;1.1×Super PCR Mix、DL2000 DNA Marker 北京擎科生物技術(shù)有限公司;Q5高保真DNA聚合酶2×預(yù)混液、BsaI-HFv2(含10×CutSmart Buffer)、ATP NEB(北京)有限公司;平末端DNA加A試劑盒 北京博凌科為生物科技有限公司;Gateway LR Clonase II Enzyme Mix(含蛋白酶K)、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent、HBSS 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)、1×PBS、胰蛋白酶(0.25% Trypsin & 0.02% EDTA) Biological Industries公司;聚凝胺、嘌呤霉素 上海翊圣生物科技有限公司;SYBR Premix ExTaq II、Primescript RT reagent Kit with gDNA Eraser 寶生物工程(大連)有限公司;乳酸含量檢測試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司;葡萄糖測定試劑盒(葡萄糖氧化酶法) 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;IX53型倒置顯微鏡 OLYMPUS公司;HF240型CO2培養(yǎng)箱、NeoFuge 1600R型離心機 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;DYCP-32B型瓊脂糖水平電泳槽、DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYY-2C型電泳儀電源 北京六一儀器廠;ES-60型恒溫孵育搖床 杭州米歐儀器有限公司;Veriti 96-well Thermal Cycler PCR儀 Life Technologies公司;Image Quant LAS 4000 mini型發(fā)光圖像分析儀 美國通用電氣公司;GBox F3型凝膠成像系統(tǒng) Syngene 公司;Rotor-Gene Q型2通道熒光定量PCR儀 QIAGEN公司;FE20型pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;1510型全波長酶標儀 Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Golden Gate法構(gòu)建表達載體

1.2.1.1 總RNA提取 取小鼠背最長肌,用動物組織總RNA提取試劑盒提取總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和A260/A280比值檢測RNA完整性和純度。

1.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 以總RNA為模板,用TIANScript II cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.1.3 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI上公布的小鼠PKM1的cDNA序列(NM_001253883.1)設(shè)計引物。正向引物:5′ATGCCGAAGCCACACAGTGAAGC3′,反向引物:5′TCAAGGTACAGGCACTACACGCATG3′。含起始密碼子和終止密碼子。

1.2.1.4 目的片段的擴增回收 以cDNA 第一鏈為模板,加入上述引物(1.2.1.3)以及Q5高保真DNA聚合酶2×預(yù)混液,PCR擴增目的基因(PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按Q5高保真DNA聚合酶2×預(yù)混液說明書操作)。擴增出的序列為小鼠PKM1的完整雙鏈cDNA,全長1596 bp。PCR產(chǎn)物用含EB染料的1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下根據(jù)DNA Marker確定目的片段位置并切膠用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。

1.2.1.5 目的片段與T載體連接 用高保真酶擴增出的DNA片段是平末端,無法直接與T載體連接。因此,先用平末端DNA加A試劑盒在目的片段3′末端加上一個A堿基,然后再與線性化pGEM-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞(連接和轉(zhuǎn)化步驟按T載體說明書進行)并加入SOC培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)1.5 h后,吸取部分菌液涂布到含氨芐青霉素的LB平板中,37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取陽性單克隆菌落進行PCR鑒定。對鑒定正確的菌落進行搖菌培養(yǎng)。用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒pGEM-T-mPKM1,并測序鑒定目的片段序列是否正確。

1.2.1.6 加酶切位點 以測序正確的質(zhì)粒pGEM-T-mPKM1為模板,設(shè)計帶有BsaI酶切位點及其保護堿基的引物,進行PCR。正向引物:5′ atcgGGTCTCG CAAGATGCCGAAGCCACACAGTGAAGC3′,反向引物:5′atcgGGTCTCGGGGTTCAAGGTACAGGCACTACA CGCATG3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段。

1.2.1.7 入門載體的構(gòu)建 以骨架載體pDown-3×FLAG-BsaI-ccdB-Cm-BsaI和PCR產(chǎn)物(1.2.1.6)進行Golden Gate反應(yīng),構(gòu)建入門載體pDown-3×FLAG/mPKM1。反應(yīng)體系:0.75 μL BsaI-HFv2,1 μL 10×CutSmart Buffer,1 μL 10 mmol/L ATP,0.25 μL T7 DNA 連接酶,1 μL 20 ng/μL PCR產(chǎn)物,1 μL 100 ng/μL骨架載體,滅菌雙蒸水補足至10 μL。反應(yīng)程序:37 ℃ 5 min,20 ℃ 5 min,共15個循環(huán),然后80 ℃滅活20 min。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細胞,涂布到含卡那霉素的LB平板中,培養(yǎng)過夜后挑取單克隆菌落進行菌落PCR鑒定。鑒定正確的克隆菌落搖菌培養(yǎng)后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,并送質(zhì)粒測序鑒定目的基因序列是否正確,測序引物4條(表1)。

表1 測序引物名稱及序列Table 1 Name and sequence of primer used for sequencing

1.2.1.8 表達載體構(gòu)建 將測序正確的質(zhì)粒(1.2.1.7)進行Gateway反應(yīng)。13 ng啟動子入門克隆 pUp-EF1A,13 ng入門載體pDown-3×FLAG/mPKM1,60 ng pLV.Des2d.C/EGFP:T2A:Puro骨架載體,1 μL Gateway LR Clonase II Enzyme Mix,TE buffer 補足至5 μL。25 ℃反應(yīng)3 h后加入蛋白酶K終止反應(yīng)10 min。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細胞,涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)。挑取單克隆菌落進行PCR,篩選陽性克隆,擴大培養(yǎng)后用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒,酶切鑒定載體。鑒定正確的載體即為最終的表達載體pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>3xFLAG/mPKM1。

1.2.2 慢病毒包裝

1.2.2.1 293T細胞培養(yǎng) 轉(zhuǎn)染前1 d,接種293T細胞到10 cm培養(yǎng)皿中,以轉(zhuǎn)染當天的細胞達到90%匯合度為宜,轉(zhuǎn)染前1 h時更換10 mL新鮮的完全培養(yǎng)基(90% DMEM+10% FBS)。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)染293T細胞 取1.5 mL滅菌EP管加入500 μL無血清DMEM,2 μg包裝質(zhì)粒Mix和2 μg表達載體質(zhì)粒,混勻后靜置5 min。另取一個1.5 mL滅菌EP管加入500 μL無血清DMEM以及8 μL轉(zhuǎn)染試劑充分混勻后靜置5 min。將兩個EP管中的混合物合在一起混勻,靜置20 min后逐滴加到細胞培養(yǎng)皿中,共轉(zhuǎn)染293T細胞,輕輕混勻后置于細胞培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染5 h后,更換10 mL完全培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2.3 慢病毒收集濃縮 分別在48、72 h時,收集富含慢病毒顆粒的培養(yǎng)基到15 mL離心管中,500×g離心5 min去除細胞沉淀,回收上清,用0.45 μm的濾器過濾,收集濾液,50000×g高速離心2 h,棄上清。用適量HBSS充分溶解病毒沉淀,即為濃縮慢病毒。

1.2.2.4 qPCR法測定慢病毒滴度 制作qPCR標準品:將細胞內(nèi)已知拷貝數(shù)的ALB基因克隆到載體并提取質(zhì)粒,作為標準品1。標準品2為慢病毒表達質(zhì)粒(含WPRE基因)。轉(zhuǎn)導(dǎo)前1 d,接種293T細胞到6孔板中,轉(zhuǎn)導(dǎo)前,消化一個孔的細胞進行計數(shù),獲取靶細胞數(shù)(A);病毒稀釋一定倍數(shù)(B),轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細胞(V,mL),加入聚凝胺促進感染。48 h后,收集細胞并提取基因組DNA。

qPCR:用兩條標準曲線分別獲取DNA樣品的ALB拷貝數(shù)和WPRE拷貝數(shù),計算出平均每個樣品中病毒序列的拷貝數(shù)C,進而根據(jù)以下公式計算出慢病毒滴度。

病毒滴度(TU/mL)=A×B×C/V

1.2.3 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

1.2.3.1 最佳MOI值的確定 將C2C12細胞用胰蛋白酶消化成單細胞,細胞計數(shù)后按3×105cells/孔 接種至6孔板內(nèi),加入2 mL完全培養(yǎng)基后置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將慢病毒配成感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為10、20、30、40、50的稀釋液并加入各孔中,繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后,根據(jù)EGFP的表達情況確定最佳MOI值。

1.2.3.2 最佳抗生素篩選濃度的確定 按1.2.3.1方法接種并培養(yǎng)細胞。24 h后,加入嘌呤霉素進行篩選。設(shè)0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 μg/mL共6個濃度梯度,每個梯度設(shè)2個復(fù)孔。觀察并記錄細胞生長狀況,每2 d換一次新的含抗生素的培養(yǎng)基,繼續(xù)篩選?？股刈罴押Y選劑量為3～4 d內(nèi)導(dǎo)致全部細胞死亡的最低濃度。

1.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選

1.2.4.1 細胞準備 按1.2.3.1方法接種細胞,加入2 mL完全培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.4.2 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) 細胞匯合度在30%～50%時,更換1 mL新鮮完全培養(yǎng)基,用胰酶消化其中一孔細胞并進行計數(shù)。將慢病毒在4 ℃下融解,輕輕混勻。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果、病毒滴度和MOI計算病毒加入的量,每孔加入終濃度為5 μg/mL的聚凝胺提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,充分搖勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后觀察細胞狀態(tài)(若見細胞有明顯毒性反應(yīng),可將轉(zhuǎn)導(dǎo)時間縮短為6～8 h),并更換2 mL新鮮的完全培養(yǎng)基。48 h后拍照,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4.3 細胞純化 按照病毒的篩選基因puro,對轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細胞更換為含最佳濃度嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行藥篩。每2 d更換新鮮的藥篩培養(yǎng)基,繼續(xù)傳代擴增。細胞數(shù)量達到理想要求后,進行凍存及RT-qPCR和WB檢測。

1.2.5 RT-qPCR檢測目的基因mRNA表達量

1.2.5.1 細胞總RNA提取 提取總RNA并進行去DNA處理。

1.2.5.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄 用 Takara Primescript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行總RNA的反轉(zhuǎn)錄。

1.2.5.3 熒光定量PCR 以β-actin為內(nèi)參,用 SYBR Green I染料法對目的基因表達情況進行相對定量,每個樣品做三個平行,相對定量采用 2-ΔΔCT法。qPCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序按表2、表3進行(步驟2 60 ℃復(fù)性延伸時收集熒光信號),引物信息見表4。

表2 qPCR反應(yīng)體系Table 2 qPCR reaction system

表3 qPCR反應(yīng)程序Table 3 Reaction procedure of qPCR

表4 引物信息Table 4 Primer information

表2 qPCR反應(yīng)體系Table 2 qPCR reaction system

1.2.6 Western Blot檢測目的蛋白的表達量

1.2.6.1 誘導(dǎo)細胞分化 將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的三種C2C12細胞(野生型、空載體、過表達)用胰蛋白酶消化后按3×105cells/孔接種到6孔板中。用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞密度達到95%后,改用含2%HS的高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)成肌分化,每24 h更換一次培養(yǎng)基,第5 d時肌管形成率最高,收集細胞提取蛋白,同時收集培養(yǎng)基測定pH和乳酸含量。

1.2.6.2 蛋白提取 用PBS漂洗細胞后加入適量RIPA細胞裂解液,將細胞碎片和裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中(所有操作在冰上進行,所有試劑均預(yù)冷)。冰浴超聲波破碎,功率200 W,超聲20 s,間隔10 s,共25次。4 ℃ 12000×g離心10 min后收集上清液備用。

1.2.6.3 SDS-PAGE電泳 根據(jù)PKM1分子量大小(60 kDa)配制8%的分離膠,混勻后加到制膠玻璃板間,用異丙醇壓平液面。凝固后倒掉異丙醇并用雙蒸水清洗,用濾紙吸干水分。配制5%濃縮膠,加到分離膠上,插入梳子,凝固后將膠板裝入電泳槽。倒入電泳緩沖液,淹沒中間室。吸取適量蛋白樣品,與等量2×SDS-PAGE loading buffer混勻,100 ℃金屬浴加熱5 min,取8 μL加于點樣孔中,取1孔加入4 μL蛋白marker以確定目的條帶。75 V電壓電泳,待指示劑跑到底部時停止。

1.2.6.4 轉(zhuǎn)膜 電泳結(jié)束后,切除多余的膠,剪取PVDF膜并用甲醇浸泡活化10 s,將凝膠、PVDF膜和濾紙在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10 min,按照白板-海綿-3層濾紙-PVDF膜-凝膠-3層濾紙-海綿-黑板的順序放置,250 mA恒流冰浴轉(zhuǎn)膜1 h后取出PVDF膜。

1.2.6.5 封閉 PVDF用TBST洗滌液漂洗膜3次,5 min/次,洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。加入封閉液,室溫振蕩孵育1 h。

1.2.6.6 抗體孵育及顯色成像 封閉結(jié)束后漂洗膜3次。分別用兔抗鼠PKM1一抗和鼠抗FLAG一抗4 ℃孵育過夜,漂洗膜3次,再分別用羊抗兔二抗和馬抗鼠二抗與對應(yīng)的膜室溫搖動孵育膜1 h。漂洗3次后用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光成像并用Image J對蛋白進行定量。

1.2.7 細胞培養(yǎng)基的pH和乳酸含量測定

1.2.7.1 pH測定 用pH計直接測定各組培養(yǎng)基的pH。

1.2.7.2 乳酸含量測定 用乳酸含量測定試劑盒按照說明書進行測定。

1.2.8 C2C12細胞的葡萄糖消耗試驗 將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的三種C2C12細胞(野生型、空載體、過表達)用胰蛋白酶消化,然后用含10% FBS+1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為2×105cells/mL,接種到12孔板中,每孔2 mL(即4×105cells/孔),培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。用PBS洗滌后,更換為無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基饑餓細胞12 h,使其同步化。再次吸棄培養(yǎng)基,用PBS洗滌后,更換為2 mL含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,同時設(shè)空白組(只加含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,不加細胞)。24 h后吸取各孔培養(yǎng)基,用葡萄糖測定試劑盒檢測培養(yǎng)基中剩余葡萄糖含量,并按以下方法計算:

葡萄糖含量(mmol/L)=樣本管吸光度/校準管吸光度×校準液濃度(5.55 mmol/L)

葡萄糖消耗量則按下式計算:

ΔGC=GC0-GCx

式中：ΔGC:各組細胞葡萄糖消耗量,mmol/L;GC0:未接種細胞的空白組中24 h后的葡萄糖含量,mmol/L;GCx:各組細胞培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基中剩余的葡萄糖含量,mmol/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Image J 1.52a計算條帶灰度值從而對蛋白進行定量。pH、乳酸含量以及葡萄糖消耗試驗各設(shè)3個生物學(xué)重復(fù),每個重復(fù)測量三次。用SPASS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析和顯著性檢驗,并用Prism 8.0.2繪圖,實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA完整性和純度檢測

提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定出5S、18S和28S三條帶(圖1),A260/A280比值為2.05,說明提取的RNA完整性較好,純度較高,可以用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

圖1 小鼠背最長肌總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Total RNA s of mouse longissimus dorsi 注:1、2:提取的總RNA。

2.2 目的片段擴增

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板,經(jīng)PCR擴增獲得小鼠PKM1編碼區(qū)序列,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)了與預(yù)期大小(1596 bp)相符的條帶(圖2)。經(jīng)測序,目的條帶與NCBI公布的小鼠PKM1基因cDNA序列相似性為100%。

圖2 小鼠PKM1基因cDNA電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of cDNA of mouse PKM1 gene注:Marker:DL2000 DNA分子量標準;1:目的片段。

2.3 表達載體的酶切鑒定

用NheⅠ和ApaLⅠ酶切組合對表達載體(圖3)進行酶切鑒定,預(yù)測會產(chǎn)生1246、2521、3287、3985 bp四個片段。實際酶切結(jié)果與預(yù)測結(jié)果一致,說明表達載體構(gòu)建正確。測序結(jié)果表明,目的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫公布序列相似性為100%。

圖3 表達載體圖譜及其酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Expression vector map and its enzyme digestion results注:Marker:GeneRuler 1 kb DNA分子量標準;1:NheⅠ和ApaLⅠ酶切產(chǎn)生的片段。

2.4 慢病毒滴度測定

經(jīng)qPCR測定,濃縮后的慢病毒滴度為3.4×108TU/mL,該滴度可滿足后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗。

2.5 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

用熒光顯微鏡放大100倍觀察不同MOI和不同抗生素濃度下的細胞形態(tài),確定最佳MOI為30,最佳嘌呤霉素篩選濃度為1.2 μg/mL。如圖4所示,A、B和C、D分別為最佳MOI和最佳藥篩濃度下感染48 h后過表達組和對照組C2C12細胞的白光圖和熒光圖。由圖4A、圖4C可以看出細胞貼壁生長且呈梭狀,符合該細胞的形態(tài)特征,說明慢病毒對細胞形態(tài)無明顯損傷。從圖4B、圖4D可以看出,感染上慢病毒表達載體的細胞由于表達綠色熒光蛋白而呈現(xiàn)綠色,EGFP熒光率達80%以上,說明,感染成功,感染效率良好。

圖4 最佳轉(zhuǎn)染條件下的細胞狀態(tài)Fig.4 Cell state under the optimal transfection conditions

2.6 qPCR檢測目的基因mRNA表達量

用相對定量的方法檢測目的基因的表達變化,按照2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行分析處理。結(jié)果表明,過表達組FLAG-mPKM1的表達量大約是對照組的9.4萬倍(表5)。

表5 目的基因相對表達量Table 5 Relative expression level of target gene

2.7 Western Blot檢測目的蛋白的表達量

用PKM1抗體進行Western Blot檢測時,過表達組檢測到兩條目的條帶,分別是內(nèi)源性PKM1條帶和帶有Flag標簽的外源PKM1條帶,由于外源性條帶含有3×FLAG標簽,因此,蛋白分子量略微大于內(nèi)源性的,而轉(zhuǎn)空載體的細胞和野生型細胞只有一條內(nèi)源性的PKM1條帶。用FLAG標簽抗體進行Western Blot檢測時,過表達組由于含有FLAG標簽,因此有一條帶,而空載體組和野生型組由于不含F(xiàn)LAG標簽因此沒有條帶(圖5A)。綜合以上結(jié)果表明,成功篩選到了過表達小鼠PKM1基因的C2C12細胞株且目的蛋白成功在細胞內(nèi)表達,且經(jīng)灰度值分析,內(nèi)源性PKM1的表達量在三組之間無顯著性差異。

圖5 目的蛋白的Western Blot檢測(A)及內(nèi)源性PKM1相對表達量(B)分析Fig.5 Western Blot results of target protein(A)and relative level(B)of endogenous PKM1注:1:過表達組;2:空載體組;3:野生型組。n=3,字母不同代表顯著性差異(P<0.05);圖6～圖8同。

2.8 細胞培養(yǎng)基的pH和乳酸含量以及葡萄糖消耗量測定

細胞糖酵解產(chǎn)生乳酸并釋放到培養(yǎng)基中,乳酸積累導(dǎo)致培養(yǎng)基pH下降。因此,測定培養(yǎng)基的pH、乳酸含量以及葡萄糖的消耗量可以反映細胞的糖酵解情況。結(jié)果表明,空載體組與野生型組相比,培養(yǎng)基的pH、乳酸含量、葡萄糖消耗量均無顯著性差異。但是與野生型組和空載體組相比,過表達組培養(yǎng)基的pH顯著降低,乳酸含量以及葡萄糖消耗量顯著增加(圖6～圖8)。說明過表達組細胞的糖酵解加劇,從圖5B可知,三組之間內(nèi)源性PKM1的量一致,由此推斷過表達組糖酵解加劇是由外源過表達的FLAG-mPKM1造成的。

圖6 培養(yǎng)基pHFig.6 pH values of culture fluid

圖7 培養(yǎng)基乳酸含量Fig.7 Lactic acid content in culture fluid

圖8 各組細胞的葡萄糖消耗量Fig.8 Glucose consumption of cells in each group

3 結(jié)論

本研究用“Golden Gate”法構(gòu)建了小鼠PKM1基因慢病毒過表達載體并轉(zhuǎn)染C2C12細胞,摸索出了慢病毒感染靶細胞的最佳條件:感染復(fù)數(shù)為30,嘌呤霉素濃度為1.2 μg/mL。成功篩選出了穩(wěn)定過表達目的基因的細胞株。過表達組中FLAG-PKM1的mRNA表達量約是對照組的9.4萬倍。FLAG-PKM1融合蛋白成功在宿主細胞內(nèi)表達。通過測定培養(yǎng)基的pH、乳酸含量以及葡萄糖消耗初步證明PKM1促進了細胞的糖酵解。篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株為進一步研究PKM1蛋白翻譯后修飾對其自身酶活以及細胞糖酵解的影響奠定了材料基礎(chǔ)。