沈丹蕓，董科，范紫瑋，陳靜嫻，何迅，裴曉方*

(1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院(華西第四醫(yī)院)，成都 610041；2.食品安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

豆豉是黑豆或黃豆經(jīng)微生物發(fā)酵而制成的一種歷史悠久的中國(guó)傳統(tǒng)調(diào)味食品，因具有獨(dú)特的風(fēng)味而廣受大眾的喜愛(ài)[1]。豆豉一般分為毛霉型、曲霉型、根霉型和細(xì)菌型[2]。水豆豉為細(xì)菌型豆豉，用其制作的菜品“色、香、味”俱全，在四川、云南和貴州等地區(qū)得以普遍食用。

水豆豉生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大豆異黃酮、多肽、纖溶酶、維生素等多種有利于人體健康的生物活性物質(zhì)[3-6]。大豆異黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等功能，其含量和活性與水豆豉發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵菌株以及發(fā)酵條件密切相關(guān)，目前，傳統(tǒng)發(fā)酵水豆豉在微生物及流程控制方面較不規(guī)范，發(fā)酵過(guò)程繁瑣且易受雜菌污染[7]，故尋求一種高效安全的發(fā)酵方式有利于水豆豉的科學(xué)化生產(chǎn)。

本研究利用前期實(shí)驗(yàn)中篩選出的一株水豆豉高效發(fā)酵菌株純種發(fā)酵黃豆，以大豆異黃酮含量和感官評(píng)價(jià)得分為響應(yīng)值，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面法探究水豆豉發(fā)酵的最佳條件，為研發(fā)高產(chǎn)大豆異黃酮的水豆豉提供了思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷、染料木素、大豆黃素、黃豆黃素：均購(gòu)自成都德思特生物科技有限公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純；乙腈、甲醇、冰乙酸：均購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000液相色譜儀 美國(guó)DIONEX公司；GI547W高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市英峪高科儀器廠；MIR-554-PC低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本Panasonic公司；SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水豆豉的發(fā)酵過(guò)程

稱取試樣黃豆30 g，加入90 mL蒸餾水，浸泡12 h后，瀝干水分，放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃蒸煮30 min，冷卻至室溫，接入一定量菌液，在一定的發(fā)酵溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，獲得純種菌株發(fā)酵的水豆豉。

1.3.2 大豆異黃酮的測(cè)定

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26625-2011《糧油檢驗(yàn) 大豆異黃酮含量測(cè)定 高效液相色譜法》進(jìn)行檢測(cè)[8]。

1.3.3 感官評(píng)價(jià)指標(biāo)

評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以文獻(xiàn)[9,10]為參考，將水豆豉的形態(tài)、黏液、拉絲、氣味和口感作為評(píng)價(jià)指標(biāo)(見(jiàn)表1)，由來(lái)自食品相關(guān)專業(yè)的實(shí)驗(yàn)人員組成3人評(píng)價(jià)小組，各成員分別判別評(píng)分后得出的平均分為水豆豉的感官評(píng)價(jià)結(jié)果。

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表1 水豆豉感官評(píng)價(jià)指標(biāo)Table 1 The sensory evaluation indexes of fermented soybeans

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續(xù) 表

注：拉絲長(zhǎng)度測(cè)定：將水豆豉攪拌2 min后，用槍頭挑起，以10 cm為一個(gè)單位，從中間挑起，垂直拉10 cm為兩個(gè)單位，再?gòu)睦鸬?0 cm中挑起，重復(fù)進(jìn)行，直至拉絲斷裂，記錄拉絲單位。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

分別選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接菌量對(duì)水豆豉發(fā)酵進(jìn)行條件優(yōu)化。

1.3.4.1 發(fā)酵溫度對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響

在發(fā)酵時(shí)間為4 d，接菌量為3%，發(fā)酵溫度分別為20，25，30，35，40，45 ℃的情況下發(fā)酵，考察水豆豉樣品的大豆異黃酮含量和感官評(píng)價(jià)得分的變化。

1.3.4.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響

在接菌量為3%，發(fā)酵溫度為35 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為1，2，3，4，5，6 d的情況下發(fā)酵，考察水豆豉樣品的大豆異黃酮含量和感官評(píng)價(jià)得分的變化。

1.3.4.3 接菌量對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響

在發(fā)酵溫度為35 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4 d，接菌量分別為0.5%、1%、3%、5%、7%、9%的情況下發(fā)酵，考察水豆豉樣品的大豆異黃酮含量和感官評(píng)價(jià)得分的變化。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化水豆豉發(fā)酵條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken模型，選取水豆豉中大豆異黃酮的含量(Y1)、感官評(píng)價(jià)得分(Y2)為響應(yīng)值，得出共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，利用軟件進(jìn)行結(jié)果分析并得出水豆豉發(fā)酵的最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度是水豆豉發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素。由圖1可知，水豆豉中檢測(cè)到的大豆異黃酮含量在發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)最高，20～40 ℃時(shí)，隨著溫度的升高而增高，40 ℃之后隨著溫度升高呈下降趨勢(shì)，感官評(píng)價(jià)得分變化與大豆異黃酮含量變化一致。這可能是由于溫度在一定范圍內(nèi)增高，有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝，但溫度過(guò)高，反而會(huì)阻礙細(xì)菌的增殖?？紤]到枯草芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度一般為30～40 ℃[11-13]，故將水豆豉發(fā)酵溫度范圍縮小為30～40 ℃進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響Fig.1 The effect of fermentation temperature on the fermentation of fermented soybeans

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響Fig.2 The effect of fermentation time on the fermentationof fermented soybeans

由圖2可知，水豆豉中檢測(cè)到的大豆異黃酮含量在6 d時(shí)達(dá)到最大，1～6 d隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而升高。而感官評(píng)價(jià)得分在4 d時(shí)最高，4 d之后開(kāi)始下降。結(jié)合兩種因素的變化以及從經(jīng)濟(jì)和效率方面考慮，縮小發(fā)酵時(shí)間范圍為3～5 d進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 接菌量對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響

圖3 接菌量對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響Fig.3 The effect of inoculation amount on the fermentation of fermented soybeans

由圖3可知，水豆豉中檢測(cè)到的大豆異黃酮含量在接菌量為5%時(shí)最高，小于5%時(shí)，大豆異黃酮含量隨接菌量增多而升高，在5%之后再增大接菌量，大豆異黃酮含量的變化趨于平穩(wěn)。感官評(píng)價(jià)得分同樣在接菌量為5%時(shí)達(dá)到最大。以上的變化可能與接菌量過(guò)大時(shí)細(xì)菌間相互競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間進(jìn)而阻礙細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖接菌量以及過(guò)小時(shí)黃豆發(fā)酵不充分有關(guān)。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，縮小接菌量范圍為1%～5%進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面法確定最優(yōu)發(fā)酵方案

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken模型，以發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、接菌量(C)為考察因素，以感官評(píng)價(jià)得分(Y1)和大豆異黃酮含量(Y2)為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的中心組合設(shè)計(jì)。Box-Behnken模型設(shè)計(jì)因素和水平見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken模型設(shè)計(jì)因素和水平表Table 2 The factors and levels of Box-Behnken model design

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

運(yùn)用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建出以下兩組回歸擬合模型：

Y1=72.40+1.00A+0.31B-2.19C-0.88AB-1.38AC-1.25BC+1.67A2-1.95B2+0.05C2。

Y2=839.30+46.40A+31.26B-78.70C-91.01AB+43.43AC-9.84BC+40.60A2-116.64B2-68.67C2。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

分別對(duì)兩組回歸擬合模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。兩模型的P值分別為P=0.0079<0.01，P=0.0004<0.01，說(shuō)明該模型有意義且可以與實(shí)際結(jié)果相擬合。兩模型的失擬項(xiàng)P值分別為P=0.5072>0.1，P=0.5570>0.1。模型無(wú)失擬因素存在，說(shuō)明模型與實(shí)際結(jié)果擬合較好。以上結(jié)果說(shuō)明可以運(yùn)用此方程進(jìn)行實(shí)際結(jié)果的預(yù)測(cè)。

表4 Y1回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis of regression equation Y1

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

表5 Y2回歸模型方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis of regression equation Y2

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

由表4可知，A，C因素對(duì)感官評(píng)價(jià)得分的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且C因素的影響更為顯著，曲面效應(yīng)A2和B2對(duì)感官評(píng)價(jià)得分的影響也有相關(guān)性。由表5可知，B、AC、A2項(xiàng)對(duì)大豆異黃酮含量響應(yīng)值關(guān)系較小，而A、C、AB、B2、C2項(xiàng)對(duì)大豆異黃酮含量的影響具有顯著效應(yīng)，由F值大小可以判斷，以大豆異黃酮的含量為響應(yīng)值，A，B，C各因素對(duì)水豆豉發(fā)酵的影響大小的排列順序?yàn)椋篊>A>B，即接菌量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用的分析與優(yōu)化

為了進(jìn)一步研究影響水豆豉發(fā)酵因素的交互作用以確定最優(yōu)水豆豉發(fā)酵條件，對(duì)影響水豆豉發(fā)酵因素的交互作用進(jìn)行分析?？紤]到感官評(píng)價(jià)得分具有較高的主觀性，于是，在此考察對(duì)大豆異黃酮含量這一響應(yīng)值產(chǎn)生影響的交互作用，經(jīng)軟件分析得出以下結(jié)果。

當(dāng)接菌量為3%時(shí)，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)大豆異黃酮含量的響應(yīng)面曲線見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)大豆異黃酮含量的響應(yīng)面曲線Fig.4 Response surface plot for the effect of cross-interaction between fermentation temperature and fermentation time on soybean isoflavone content

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，大豆異黃酮含量隨發(fā)酵時(shí)間增加而升高；在發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)，大豆異黃酮含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而降低；但在發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)變化較為明顯。在發(fā)酵時(shí)間為3 d時(shí)，大豆異黃酮含量隨發(fā)酵溫度增高而增高；在發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，大豆異黃酮含量隨發(fā)酵溫度增高而降低；但在發(fā)酵時(shí)間為3 d時(shí)，變化較為明顯。

當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為3 d時(shí)，發(fā)酵溫度與接菌量的交互作用對(duì)大豆異黃酮含量的響應(yīng)面曲線見(jiàn)圖5。

由圖5可知，當(dāng)接菌量一定時(shí)，大豆異黃酮的含量隨發(fā)酵溫度升高而增高，尤其是在接菌量為5%時(shí)，變化較為明顯。當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí)，大豆異黃酮的含量大體上隨著接菌量的增加而增高，尤其是在發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，變化較為明顯。

圖5 發(fā)酵溫度與接菌量交互作用對(duì)大豆異黃酮含量的響應(yīng)面曲線Fig.5 Response surface plot for the effect of cross-interaction between fermentation temperature and inoculation amount on soybean isoflavone content

當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，發(fā)酵時(shí)間與接菌量的交互作用對(duì)大豆異黃酮含量的響應(yīng)面曲線見(jiàn)圖6。

圖6 發(fā)酵時(shí)間與接菌量交互作用對(duì)大豆異黃酮含量的響應(yīng)面曲線Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between fermentation time and inoculation amounton soybean isoflavone content

由圖6可知，當(dāng)接菌量一定時(shí)，大豆異黃酮的含量隨發(fā)酵時(shí)間增加先增高后降低，在4 d左右達(dá)到最大值。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間一定時(shí)，大豆異黃酮的含量隨著接菌量的增加反而降低。

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)一步計(jì)算得到以大豆異黃酮含量和感官評(píng)價(jià)得分為響應(yīng)值的水豆豉最優(yōu)發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為40 ℃，發(fā)酵時(shí)間為3.91 d(69.84 h)，接菌量為1.05%。為了實(shí)際操作和生產(chǎn)過(guò)程的便利性，將此條件調(diào)整為發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間4 d、接菌量1.00%。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)調(diào)整后的結(jié)果得到的理論最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次后取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of validation experiments

由表6可知，依照最優(yōu)條件進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后得到的實(shí)驗(yàn)平均值分別為感官評(píng)價(jià)得分74.50分，大豆異黃酮含量881.28 mg/kg，與模型計(jì)算值78.52分，898.51 mg/kg較為接近，說(shuō)明利用響應(yīng)面法對(duì)水豆豉最優(yōu)發(fā)酵條件的結(jié)果預(yù)測(cè)較為準(zhǔn)確。

3 討論

水豆豉作為西南地區(qū)群眾喜食的食品，對(duì)于其有益成分的研究和開(kāi)發(fā)具有一定的價(jià)值，但目前對(duì)中藥淡豆豉、霉菌型豆豉發(fā)酵產(chǎn)大豆異黃酮條件優(yōu)化的報(bào)道較多[14-18]，對(duì)水豆豉發(fā)酵產(chǎn)大豆異黃酮條件優(yōu)化的報(bào)道極少，因此，本研究對(duì)水豆豉純種發(fā)酵產(chǎn)大豆異黃酮條件優(yōu)化的資料進(jìn)行了補(bǔ)充。本研究結(jié)果中，水豆豉在最優(yōu)條件下產(chǎn)大豆異黃酮含量為881.28 mg/kg，與未發(fā)酵黃豆的大豆異黃酮含量(645.78 mg/kg)相比高出36.47%，說(shuō)明最優(yōu)條件下發(fā)酵水豆豉的確使得水豆豉中生物活性成分——大豆異黃酮含量大幅增加，與劉亞瓊等[19]報(bào)道的四川地區(qū)豆豉中大豆異黃酮含量的平均值428 mg/kg相比，高出1倍左右，說(shuō)明本研究結(jié)果具有實(shí)際意義。

本研究采用響應(yīng)面法對(duì)水豆豉的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，此法在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以及數(shù)學(xué)模型，巧妙地運(yùn)用了具有代表性的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)通過(guò)計(jì)算得到最優(yōu)響應(yīng)值，相比于傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精密度及準(zhǔn)確度較高等優(yōu)點(diǎn)[20]，故本研究結(jié)果較為可靠，可以為水豆豉的發(fā)酵工藝提供思路。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面法Box-Behnken模型，以大豆異黃酮和感官評(píng)價(jià)得分為響應(yīng)值純種發(fā)酵黃豆，得到以發(fā)酵溫度為40 ℃、發(fā)酵時(shí)間為4 d、接菌量為1.00%的最優(yōu)發(fā)酵條件，在此條件下發(fā)酵得到水豆豉感官評(píng)價(jià)得分為74.50分、大豆異黃酮含量為881.28 mg/kg的最高結(jié)果值，此結(jié)果中大豆異黃酮含量和未發(fā)酵黃豆的大豆異黃酮含量相比有明顯升高。

不同于傳統(tǒng)發(fā)酵水豆豉發(fā)酵周期長(zhǎng)且質(zhì)量難以控制，本研究為純種發(fā)酵水豆豉，通過(guò)研究結(jié)果得出最優(yōu)發(fā)酵條件，為水豆豉的科學(xué)生產(chǎn)以及相關(guān)食品、保健品的開(kāi)發(fā)提供了理論參考。