付建鑫，邵家威，方奕珊，張桂香*

(1.濟南大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)系，濟南 250002；2.齊魯工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟南 250353)

灰綠堿蓬(SuaedaglaucaBunge.)，又名黃須菜，是一年生藜科堿蓬屬草本鹽生植物，多生長于灘涂及荒漠處，是鹽堿地的特征植物。近些年來，岸基濕地、灘涂等土壤鹽漬化現(xiàn)象日益嚴(yán)重，耕地土壤土質(zhì)硬化，耕地資源緊缺，迫使人們不得不考慮開發(fā)利用鹽生植物資源，所以研究及推廣鹽生植物的種植勢在必行。堿蓬在我國不僅分布廣泛，而且產(chǎn)量高。據(jù)統(tǒng)計，每年僅黃河三角洲地區(qū)的堿蓬產(chǎn)量就高達(dá)3.3×105t[1]。植物多糖除具有一般膳食纖維的特性外，還具有乳化及乳化穩(wěn)定性、酸性條件下對蛋白顆粒的穩(wěn)定作用、抗黏結(jié)性、成膜性及泡沫穩(wěn)定性等特性，在食品工業(yè)有較多的應(yīng)用。作為乳化劑已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在了咖啡奶油、乳化型調(diào)味料、咖啡伴侶以及牛奶蛋黃奶油中；作穩(wěn)定劑的乳飲料類則口感更為清爽。除此之外，在人造奶油、色拉調(diào)味油、奶油調(diào)味汁等食品中，它可部分代替脂肪，保持水分，增加產(chǎn)品的稠感和黏附感[2]。

目前國內(nèi)外主要著眼于鹽地堿蓬、硬翅堿蓬耐鹽機理研究及活性物質(zhì)提取等方面，對灰綠堿蓬的多糖研究暫未報道。本研究以灰綠堿蓬為研究對象，測定了根、莖、葉及全株的基本營養(yǎng)成分，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取了堿蓬多糖并對其脫色方式進行了探究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

灰綠堿蓬：采自山東東營；皂土、十六烷基三甲基溴化銨、HZ-800大孔樹脂：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；石油醚、無水乙醇、硫酸銅、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、葡萄糖等試劑：均為分析純。

702A紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；PHS-3B pH酸度計 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；FA2004N 電子天平 上海上平儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰綠堿蓬基本成分測定

1.2.1.1 蛋白質(zhì)含量測定

按GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》執(zhí)行。

1.2.1.2 總糖含量測定

按GB/T 15672—2009《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食用菌中總糖含量的測定》執(zhí)行。

1.2.1.3 脂肪含量測定

按GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》執(zhí)行。

1.2.1.4 黃酮含量測定

按GB/T 20574—2006《蜂膠中總黃酮含量的測定方法 分光光度比色法》執(zhí)行。

1.2.1.5 皂苷含量測定

按GB/T 22464—2008《大豆皂苷》執(zhí)行。

1.2.2 灰綠堿蓬多糖提取工藝

通過溶劑浸提法去除植株中少量脂肪及大量可溶性色素[3]。過量正己烷回流脫脂4～6 h，將脫脂后的索式提取系統(tǒng)用少量水沖洗，以75%乙醇為溶劑進行色素沖洗，直至提取管內(nèi)無顏色變化為止。稱量單位質(zhì)量的已處理堿蓬干粉(200目)于燒杯中，加入一定量的沸水，封膜密閉后于超聲清洗器中浸提。將冷卻沉降后的提取上清液在8000 r/min 條件下離心10 min并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。無水乙醇按照4∶1的比例緩慢倒入濃縮提取液中并攪拌均勻，放置于4 ℃條件下冷藏，每隔3 h攪拌1次，沉淀過夜后，傾倒上層清液。下層溶液在7000 r/min 離心12 min 后，將沉淀用無水乙醇和石油醚洗滌多次后冷凍干燥，即為堿蓬粗多糖，多糖得率計算公式如下：

(1)

1.2.3 灰綠堿蓬多糖提取響應(yīng)面設(shè)計

1.2.3.1 灰綠堿蓬多糖提取單因素試驗

在單因素試驗中，主要考察了提取溫度、提取時間、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個因素。其中，控制提取時間為50 min，超聲功率為320 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，提取溫度設(shè)定為50，65，75，85 ℃；控制提取溫度為75 ℃，超聲功率為320 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，提取時間選擇30，40，50，60，70 min；控制提取溫度為75 ℃，提取時間為50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，選擇超聲功率為100，200，320，440 W；控制提取溫度為75 ℃，提取時間為50 min，超聲功率為320 W，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、55%、65%、80%。

1.2.3.2 灰綠堿蓬多糖優(yōu)化組合試驗

以單因素試驗為前提，采用L9(34)響應(yīng)面分析法，利用Design-Expert 11.0進行試驗組合模擬。

表1 試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of response surface design

由表1可知，自變量分別為A乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)、B提取時間(min)、C超聲功率(W)和D提取溫度(℃)，以-1，0，1分別表示高、中、低3個不同水平。試驗結(jié)果以多糖提取得率為響應(yīng)值(Y)，確定以上4個因素對堿蓬多糖提取的單獨影響和最優(yōu)組合，結(jié)合實際條件優(yōu)化得到熱水浸提堿蓬多糖的工藝參數(shù)。

1.2.4 灰綠堿蓬多糖的脫色研究

1.1.3 試劑 乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher公司)，磷酸二氫鉀(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，甲醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號1161116-02，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)。

1.2.4.1 HZ-800大孔樹脂吸附法脫色[4]

樹脂預(yù)處理：取適用的大孔樹脂于去離子水中充分?jǐn)嚢璺稚ⅲ恋盱o置后移去上層清液的懸浮小顆粒，重復(fù)此操作3～5次，測定pH為7左右，保證大孔樹脂顆粒的均一性。移除清液，加入2 mol/L的NaOH溶液于40 ℃條件下攪拌2 h反應(yīng)后于室溫靜置保存8 h，用去離子水沖洗至pH為7左右。同理，2 mol/L HCl按照上述操作(攪拌時封口)。將NaOH-H2O-HCl-H2O處理后的大孔樹脂抽濾，初步脫水，真空干燥后即可使用。

取溶液體積(m/V)的0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8% HZ-800大孔樹脂，與100 mL 10 mg/mL的堿蓬多糖溶液在常溫條件下以 300 r/min攪拌30 min，反應(yīng)后取上清液測定吸光值，計算脫色率。

1.2.4.2 過氧化氫法脫色[5]

30% H2O2配制成70%(V/V)的過氧化氫溶液。按照每100 mL 10 mg/mL的堿蓬多糖溶液的體積分?jǐn)?shù)，分別加入70%過氧化氫溶液(V/V) 0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8%于三角瓶中，50 ℃條件下，以80 W功率超聲25 min，反應(yīng)后取上清液測定吸光值，計算脫色率。

1.2.4.3 活性炭吸附法脫色[6]

活性炭吸附脫色為常規(guī)脫色法，根據(jù)報道進行修改。取食品級椰殼活性炭于去離子水中清洗若干次，去除上層懸浮顆粒，烘干后即可使用。分別取0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的活性炭加入到100 mL 10 mg/mL的堿蓬多糖溶液中，調(diào)節(jié)pH至6.3，溫度為40 ℃，攪拌反應(yīng)1 h，測定吸光值，計算脫色率。

1.2.4.4 復(fù)合皂土絡(luò)聯(lián)法脫色[7]

復(fù)合皂土制備：取500 g皂土加入1 L水，劇烈攪拌使其充分分散于溶劑體系，靜置后除去上層懸浮顆粒、結(jié)塊，抽濾得水洗皂土。將水洗后的潔凈、均勻皂土分散于10% H2SO4，攪拌均勻后煮沸30 min進行酸化改性，在恒溫水浴鍋95 ℃條件下坐浴6 h，每1 h攪拌1次。反應(yīng)后的體系放置冷卻至室溫，多次水洗、抽濾并用飽和Na2CO3調(diào)節(jié)pH 至5.3～5.5，過夜保存后水洗抽濾，110 ℃條件下烘干至恒重，超微粉碎至200目，即為酸改性皂土。重復(fù)以上操作，將溶劑替換為7%的十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)和1%的聚丙烯酰胺溶液中，無需調(diào)節(jié)pH，靜置過夜，烘干粉碎后，即為復(fù)合皂土。

分別取溶液體積(m/V)的0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8%復(fù)合皂土，加入到100 mL 10 mg/mL的堿蓬多糖溶液中，在40 ℃、300 r/min條件下攪拌30 min，反應(yīng)后靜置室溫于10000 r/min離心10 min，取上清液測定吸光值，計算脫色率。

1.2.4.5 提取率計算

(2)

式中：A為樣品未脫色之前的吸光值；Ax為樣品脫色之后的吸光值；θ為脫色率。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰綠堿蓬物質(zhì)成分含量

表2 各物質(zhì)成分含量Table 2 Content of various substances mg/g

注：“-”表示未測定。

由表2可知，灰綠堿蓬全植株脂肪含量極少，含有部分蛋白質(zhì)，葉片中的總黃酮、總皂苷和總糖含量較多。

2.2 灰綠堿蓬多糖單因素提取試驗結(jié)果與分析

2.2.1 提取溫度對堿蓬多糖提取得率的影響

提取溫度是影響多糖得率的一個重要因素，適宜的溫度有助于提高植物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出速度和提高多糖溶解度。

圖1 提取溫度對堿蓬多糖提取得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由圖1可知，隨著溫度逐漸升高至75 ℃，多糖得率逐漸升高，此時多糖得率最高，為1.89%。溫度繼續(xù)升高，多糖得率明顯下降。這一現(xiàn)象的原因極有可能是過高的溫度使溶出的多糖結(jié)構(gòu)被破壞。因此，提取溫度選擇75 ℃合適。

2.2.2 提取時間對堿蓬多糖提取得率的影響

在一定料液比條件下，隨著提取時間的延長，溶液中溶質(zhì)的飽和度會達(dá)到峰值，在此之后將不再增高。

圖2 提取時間對堿蓬多糖提取得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由圖2可知、當(dāng)溫度確定，溶解度一定時，提取時間達(dá)到50 min時，體系的多糖含量達(dá)到最大，之后多糖提取得率隨著時間的延長將不再變化。提取時間選取50 min適宜。

2.2.3 超聲功率對堿蓬多糖提取得率的影響

當(dāng)超聲波作用于溶液系統(tǒng)時，由于體系存在張力弱區(qū)，溶質(zhì)在超聲波作用下化學(xué)鍵及結(jié)構(gòu)將會被反復(fù)斷裂、閉合，使其與物料不斷摩擦碰撞[8]。

圖3 超聲功率對堿蓬多糖提取得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由圖3可知，當(dāng)超聲功率為320 W時，多糖浸出效果最好，提取得率最高。當(dāng)超聲功率逐漸增大，多糖得率逐漸下降，原因可能是過高強度的超聲環(huán)境對結(jié)構(gòu)化學(xué)鍵造成破壞，糖苷鍵斷裂，造成多糖結(jié)構(gòu)被破壞。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對堿蓬多糖提取得率的影響

不同比例乙醇體積分?jǐn)?shù)直接影響溶液體系達(dá)到過飽和狀態(tài)，從而影響多糖的得率。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對堿蓬多糖提取得率的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)低于65%時，體系溶液未達(dá)到過飽和狀態(tài)，只有部分多糖析出；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到65%時，沉淀較為完全，此時最大多糖得率為1.76%，繼續(xù)增加乙醇含量，多糖得率變化緩慢。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇65%。

2.3 模型參數(shù)與顯著性檢驗

根據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計，29組優(yōu)化試驗的結(jié)果見表3，方差分析及擬合見表4。

表3 提取得率響應(yīng)面試驗的設(shè)計和結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for the extraction yield

表4 提取得率響應(yīng)面回歸模型的方差分析(ANOVA)Table 4 The analysis of variance (ANOVA) of the response surface regression model for the extraction yield

注：a表示0.01的顯著水平，b表示0.001的顯著水平。

由表3可知，試驗數(shù)據(jù)由Design-Expert軟件分析擬合共得到29種組合，得到A，B，C，D和Y的二次多元回歸方程：Y(%)=2.07+0.057A+0.081B+0.12C+0.12D+5.000E-0.003AB-0.020AC+0.030AD+0.045BC+0.027BD+0.040CD-0.21A2-0.065B2-0.071C2-0.067D2。

由表4可知，組合試驗中關(guān)于二項式回歸模型的差異性統(tǒng)計分析的結(jié)果，P<0.0001說明模型方程在置信度為95%的程度上對多糖產(chǎn)率的擬合估算具有顯著性。失擬項(P=0.6317)表明模型擬合良好，試驗值的誤差相對較小。較好的模型相關(guān)系數(shù)(R2=0.9499)表明回歸方程可用于試驗實際數(shù)據(jù)的分析和結(jié)果的預(yù)測期望。此外，模型變異系數(shù)(C.V.)為5.36%，得出結(jié)論：該測試可用于統(tǒng)計分析。 A，B，C，D和A2因素對多糖提取得率的影響極顯著(P<0.0001)，而二次項B2、C2和D2則達(dá)到顯著(P<0.01)水平。各因素的影響程度排列為：C>D>B>A。AC、BD、BC和CD存在著顯著性異，AB、AD之間影響程度不顯著(P>0.05)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間二次交互項、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度二次交互項、提取時間和提取溫度二次交互項相互作用較弱，表明這些因素之間與多糖提取得率構(gòu)建的關(guān)系僅為線性關(guān)系。

2.4 灰綠堿蓬多糖脫色結(jié)果分析

大孔樹脂吸附脫色屬于物理吸附，自身表面具有較大的比表面積，可以依靠樹脂與目標(biāo)物的范德華力和氫鍵作用力進行吸附[9,10]。吸附效果穩(wěn)定，不受無機鹽離子及強離子化合物存在的影響，且適用范圍廣，強酸強堿條件下都可以使用，特別是對有機色素吸附效果較好[11]。由圖5中a可知，大孔樹脂吸附脫色整體脫色率處于較高水平，且在較低濃度就可以達(dá)到80%脫色率，最佳添加量為1.8%。

圖5 不同處理方式對多糖脫色效果的影響Fig.5 Effect of different treatment methods on the decolorization effect of polysaccharides

過氧化氫在特定條件下，如超聲、加熱條件下可以分解生成原子O[12]，即零價態(tài)，具有極強的還原性，可以將有色的物質(zhì)氧化進行脫色[13,14]，這種脫色屬于化學(xué)反應(yīng)，屬于不可逆反應(yīng)。由圖5中b可知，H2O2脫色效果隨著添加量增加逐漸增大，當(dāng)添加量達(dá)到2.3%時，體系顏色逐漸穩(wěn)定。此時，體系中色素物質(zhì)基本被氧化破壞，在反應(yīng)中也可以明顯看出體系顏色趨于淺黃色且溶液體系呈清澈狀態(tài)。造成這一現(xiàn)象的原因不僅包括色素大分子分解，還包括部分蛋白分子、帶色多酚等物質(zhì)氧化破壞，這與現(xiàn)有的報道極為相似。

活性炭吸附屬于物理吸附而非化學(xué)吸附，主要是利用微小碳粒內(nèi)密布的孔洞結(jié)構(gòu)來吸附極性較大的分子，具有廣泛性而不具備特異篩選性，故對目標(biāo)收率產(chǎn)物有一定的影響[15,16]。由圖5中c可知，當(dāng)活性炭添加量達(dá)到1.8%時，脫色效果最佳。當(dāng)添加量逐漸增加，反應(yīng)體系的脫色率降低，吸光值逐漸增大，造成這一現(xiàn)象的原因主要是過量的活性炭增加了體系的顏色深度，活性炭的色度比飽和色素的色度高。多糖的研究發(fā)現(xiàn)[17]，除pH、溫度等條件外，活性炭添加量是影響脫色的又一重要因素。

黏土類吸附劑脫色原理根據(jù)吸附動力學(xué)模型研究，分為離子交換吸附和表觀吸附兩種[18]。在表觀吸附方式中，微觀上可以分為化學(xué)鍵合吸附和靜電鍵合吸附?；瘜W(xué)吸附可以將有色的金屬離子等進行結(jié)合，形成不可逆的內(nèi)絡(luò)合層[19,20]；靜電鍵合可以將大分子的色素物質(zhì)吸附，無選擇性地形成吸附層。研究發(fā)現(xiàn)，酸改性皂土對工業(yè)廢水，特別是存在金屬顯色離子(Fe2+、Gu2+)的脫色效果較為明顯。由圖5中d可知，當(dāng)皂土添加量達(dá)到1.8%時，色素脫除率達(dá)到峰值47.4%，隨著皂土添加量的增加，反應(yīng)體系脫色率變化平穩(wěn)，這表明復(fù)合皂土對多糖具有一定的脫色效果，但還未能完全脫除色素。脫色效果不足之處可能是因為大分子色素蛋白與糖側(cè)鏈結(jié)合，降低了皂土吸附效果。

2.5 響應(yīng)面驗證試驗及脫色方式選擇

選擇活性炭、HZ-800大孔吸附樹脂、過氧化氫和復(fù)合皂土的最佳脫色工藝，此時的多糖保留率將影響產(chǎn)物得率。比較活性炭脫色最佳用量1.8%，大孔樹脂脫色最佳用量1.8%，過氧化氫最佳用量2.3%和復(fù)合皂土最佳用量1.8%時，4種脫色方式的多糖保留率差異。響應(yīng)面提取多糖驗證試驗及脫色方式選擇見表5。

表5 脫色效果與多糖保留率Table 5 Decolorization effect and polysaccharide retention rate %

由表5可知，H2O2脫色法損失多糖較多，活性炭和復(fù)合皂土法脫色效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HZ-800大孔樹脂。因此，大孔樹脂法脫色為本試驗最優(yōu)選擇方法。

根據(jù)所得理論模型數(shù)據(jù)，結(jié)合實際生產(chǎn)和操作條件可能性，優(yōu)化數(shù)據(jù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時間72 min、超聲波輔助功率438 W、溫度85 ℃，再次優(yōu)化條件下進行多次試驗得到多糖提取得率為2.19%±0.13%。與理論得率相比，數(shù)據(jù)平穩(wěn)，誤差較小且與預(yù)測值相近，證明該響應(yīng)面提取多糖的分析方法可行、數(shù)據(jù)可靠，具有理論和實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

堿蓬多糖是一種具有維持細(xì)胞滲透壓，防止水分流失的非還原性糖，由于其獨特的生物特性被人們逐漸認(rèn)知。高滲地區(qū)生長環(huán)境具有高濃度的鹽離子含量，未脫鹽的粗糖使其成為一種集調(diào)味品與功能性添加劑為一體的食品添加劑。探究適合高鹽成分多糖的脫鹽方式及其參數(shù)，可以對肉類、果蔬、味精等增鮮調(diào)味品提供應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。

試驗理論方程模型較好地模擬了提取溫度、提取時間、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和多糖提取率之間的關(guān)系，試驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，實際提取結(jié)果與理論預(yù)測值相近。結(jié)合實際生產(chǎn)情況確定了乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時間72 min、超聲功率438 W、提取溫度85 ℃為最佳提取參數(shù)，此時堿蓬多糖提取得率達(dá)到2.19%±0.13%。多糖脫色研究中，考慮在最低脫色劑使用量和脫色效果最優(yōu)情況下，選擇HZ-800大孔樹脂作為堿蓬多糖的脫色方式，此時大孔樹脂脫色最佳用量為1.8%，脫色率為95.51%，多糖保留率為79.62%。