林裕勝 江錦秀 張靖鵬 游偉 胡奇林

摘要：[目的]比較分析羊口瘡病毒疫苗株與ORFV-PN株ORFV011基因的分子特點、編碼蛋白的生物學功能差異，為福建省羊口瘡的科學防控提供理論指導。[方法]對羊口瘡疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因進行克隆和測序，運用生物信息學相關軟件比較分析兩者測序結果的差異。[結果]測序結果顯示，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因均由1137個核苷酸組成，編碼378個氨基酸。核苷酸序列和氨基酸序列相似性比較顯示，ORFV-PN與疫苗株和弱毒株D1701株ORFV011基因核苷酸序列相似性分別為98.6%和98.4%，氨基酸序列相似性均為98.7%。與疫苗株相比，ORFV-PN株共有16處核苷酸變異和5處氨基酸變異。在蛋白二級結構上，ORFV-PN株和疫苗株。α-螺旋占比分別為34.13%（129/378）和30.42%（115/378），β-轉角占比分別為6.08%（23/378）和6.88%（26/378），無規(guī)則卷曲占比分別為37.30%（141/378）和39.15%（148/378），β-折疊占比分別為22.49%（85/378）和23.54%（89/378）。蛋白三級結構上，ORFV-PN株預測的三維結構與疫苗株的三維結構在α-螺旋和無規(guī)則卷曲上有一定的差異。[結論]福建省羊口瘡病毒ORFV011基因出現(xiàn)變異，應當引起廣大獸醫(yī)工作者的重視，有關部門應當加強對羊口瘡的監(jiān)測。

關鍵詞：羊口瘡病毒;疫苗株;ORFV-PN;ORFV011基因

中圖分類號：S 852.659.1文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）02-0124-06

0 引言

（研究意義）羊口瘡病毒（Orfvirus，ORFV）是一種變異性較強的病毒，病毒基因組長度因毒株不同而有所區(qū)別。ORFVOll基因編碼的B2L蛋白是重要的免疫原性蛋白，是研究羊口瘡（Orf）新型疫苗的重要靶基因。通過比較分析羊口瘡病毒疫苗株和地方分離株ORFVOll基因的分子特點、編碼蛋白的生物學功能，可為福建省羊口瘡的診斷、流行病學調查及疫苗選擇提供理論依據(jù)。（前人研究進展）羊口瘡是羊口瘡病毒引起的一種接觸性人獸共患傳染病，該病的發(fā)病率在4%～100%，死亡率1%～59%不等。ORFV011基因全長為1137bp，編碼42kDa左右蛋白，可刺激機體產生強烈的抗體反應。ORFVOll基因位于基因組中部高度保守區(qū)域，保守性較強，常利用該基因建立PCR診斷方法及分子流行病學調查。Wang等根據(jù)ORFVOll基因建立了SYBR GreenI實時熒光定量PCR檢查方法;Wang等根據(jù)ORFVOII基因對安徽省羊口瘡病毒分離株進行鑒定及遺傳變異分析。從近年來ORFVOll基因分子遺傳特征的報道來看，該基因已經出現(xiàn)一定程度的變異，如Nagaraian等研究發(fā)現(xiàn)印度分離株的ORFV011基因與羊口瘡病毒、偽牛痘病毒和牛丘疹性口炎病毒的同源性分別為98.14%、96.29%和83.59%。王秋霞等通過對江蘇省羊口瘡病毒的分離鑒定及ORFV011基因的遺傳進化分析結果顯示，4株分離株ORFVOll基因與疫苗株的同源性僅有96.8%～98.1%，暗示羊口瘡病毒已經出現(xiàn)一定程度的變異。（本研究切入點）已有研究人員對羊口瘡病毒疫苗株和地方分離株FIL基因進行了比較分析，然而對于疫苗株和地方分離株的ORFVOll基因對比研究尚未見報道。（擬解決的關鍵問題）本研究通過對羊口瘡病毒疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因進行克隆測序，對國內外不同分離株間ORFVOll基因核苷酸序列、其推導的氨基酸序列和編碼蛋白質結構進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

福建省內某疑似患羊口瘡的羊唇部痂皮組織利用羊睪丸原代細胞分離鑒定后，命名為ORFV-PN株。

1.2 試驗材料

羊口瘡弱毒疫苗購自山東泰豐生物制品有限公司，DH5a感受態(tài)和DNA/RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;限制性內切酶BarnHI和SalI購自NEB公司;DNAMarker DL2000、DL 5000采購自TaKaRa公司;pMC100-M載體購自武漢齊美欣科生物技術有限公司;1-5Hi-Fi DNA polvmerase高保真酶購自MCLAB公司。

1.3 引物的設計合成

通過下載GenBank中公布的ORFVOll基因序列（GenBank登錄號：DQl84476），利用Olig07.0軟件結合參考文獻[12]設計1對擴增ORFVOll基因全長的特異性引物，在引物兩端添加酶切位點，引物由福州白鯨生物股份有限公司合成。上游引物ORFV011F：5-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCA-3;下游引物ORFV011R：5-GCGTCGACTTAATTTATTGGCTTGCAGAACT-3'，劃線部分分別為BamHI和SalI內切酶。

1.4 疫苗株與ORFV-PN株病毒DNA的提取和常規(guī)PCR擴增

利用全式金病毒DNA/RNA提取試劑盒分別提取疫苗株和ORFV-PN株DNA，凍存于-20℃冰箱。疫苗株和ORFV-PN株PCR反應體系均為40uL：1-5Hi-Fi DNApolymerase 20uL，模板6uL，上、下游引物（10umol·L^-1）各2uL，ddH₂O 10ul.反應程序：95℃、3min;95℃、15s，55℃、

15s，72℃、15s，30個循環(huán);72℃、5min.

1.5 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因克隆測序

將凝膠電泳上條帶正確的片段利用膠回收試劑盒進行切膠回收，回收產物與pMCl00-M載體進行連接，連接后的產物轉化至DH5a感受態(tài)細胞中，涂布LB平板，將涂布后的平板放人37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，挑取單個菌落進行培養(yǎng)，利用質粒提取試劑盒提取培養(yǎng)菌質粒，進行PCR和雙酶切驗證。將驗證正確的質粒送往福州尚亞生物技術有限公司進行測序。

1.6 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因核苷酸和氨基酸序列比較

疫苗株和ORFV-PN株測序結果利用生物信息學軟件進行比對，比較兩者在核苷酸和氨基酸水平上的突變情況;同時將測序結果與GenBank上已公布的國內外主要毒株（表1）的ORFVOll基因序列進行比對分析。

1.7 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白質一級結構與功能的比較分析

將疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因克隆測序后正確的核苷酸序列翻譯成氨基酸后分別上傳至在線軟件ProtParam、NCBI-Conserved Domain ArChltcctuIcRetrieval Tool、TMHMM2.0、SignalIP 5.0和NetNGlyc1.0Server中，對兩者的氨基酸組成和理化性質、保守結構域、跨膜區(qū)、信號肽及糖基化位點進行分析。

1.8 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白質二級結構與功能的比較分析

利用Lasergene軟件和SOPMA在線軟件對疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白的親水性、疏水性、抗原指數(shù)、α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和β-折疊的占比等進行對比分析。

1.9 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白質三級結構分析

分別將疫苗株與ORFV-PN株的ORFVOll基因推導的氨基酸序列上傳至Swiss-Model在線軟件進行蛋白3D結構預測，預測結果運用Swiss-PDB-Viewer軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因的擴增及重組質粒雙酶切

分別以提取的疫苗株和ORFV-PN株的DNA為模板進行PCR擴增，在凝膠成像系統(tǒng)下可見疫苗株和ORFV-PN株在1000bp左右有明顯片段，與預期片段大小相一致（圖1）。將疑膠電泳上條帶正確的片段利用膠回收試劑盒進行切膠回收，回收產物與PMC100-M載體進行連接，連接后的產物轉化至DH5a感受態(tài)細胞中，涂布LB平板，LB平板放人37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后挑取單個菌落進行培養(yǎng)，利用質粒提取試劑盒提取質粒，提取的質粒用BamHI和Sal I進行雙酶切，酶切后得到兩個片段，一個約為2300bp，與pMCl00-M大小相等，另一個片段約為1100bp，與目的片段大小一致（圖2）。

2.2 疫苗株和O～V-PN株ORFV011基因序列測定分析

將疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因陽性質粒送往福州尚亞生物技術有限公司進行測序，測序結果利用DNAStar和MEGA7.0軟件進行比較分析。測序結果顯示：疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因均為1137bp，編碼379個aa.核苷酸和氨基酸同源性比對結果為：疫苗株與ORFV-PN株的核苷酸序列同源性為98.6%;與疫苗株相比，ORFV-PN株共有16處核苷酸差異，分別為32位堿基C突變?yōu)镚，42位堿基C突變?yōu)門，201位堿基G突變?yōu)锳，238位堿基G突變?yōu)锳，301位堿基G突變?yōu)锳，315位堿基G突變?yōu)锳，367位堿基A突變?yōu)镃，369位堿基A突變?yōu)镃，375位堿基A突變?yōu)镚，636位堿基A突變?yōu)镚，660位堿基G突變?yōu)锳，822位堿基G突變?yōu)锳，840位堿基G突變?yōu)锳，897位堿基C突變?yōu)門，1044位堿基G突變?yōu)锳，1119位堿基C突變?yōu)門;疫苗株和ORFV-PN株氨基酸序列同源性為98.7%，與疫苗株相比，ORFV-PN株共有5處氨基酸差異，分別為11位氨基酸G突變?yōu)锳，80位氨基酸I突變?yōu)閂，100位氨基酸I突變?yōu)閂，123位氨基酸L突變?yōu)镮，126位氨基酸A突變?yōu)閠.疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因的核苷酸序列和氨基酸序列與國內外毒株的相似性分別為96.9%～99.4%和97.8%～99.1%，其中ORFV-PN株與弱毒株D1701核苷酸和氨基酸序列相似性分別為98.4%和98.7%，可見不同地區(qū)分離株ORFV011基因有一定差異。通過MEGA7.0構建遺傳進化樹發(fā)現(xiàn)，本研究中的ORFV-PN株ORFVOll基因氨基酸與新疆毒株KF666565、山西毒株HQ202153同源性最高，同時與貴州毒株KP994595較接近，處在同一進化分支上，與疫苗株和弱毒株D1701相距較遠（圖3）。

2.3 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白質一級結構、理化性質和保守結構域分析

將疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因推導的氨基酸序列分別上傳至Expasy在線軟件進行分析，從分析結果可知，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白的相對分子質量分別為41.67和41.69kDa，理論等電點均為6.01;ORFV-PN株脂肪族氨基酸指數(shù)和親水性指數(shù)與疫苗株相比均變小。利用TMHMM2.0在線軟件和SignalP 5.0在線分析結果顯示，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白均無跨膜區(qū)和信號肽。利用NetNGlYc 1.0Server在線軟件對疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白進行糖基化位點預測，結果顯示均有4個糖基化位點，沒有發(fā)生變化。經NCBI-Conserved Domain Architecture Retrieval Tool在線分析疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白的保守性結構域發(fā)現(xiàn)，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白均含有2個磷脂酶D超家族的保守結構域以及對應的特異性結合位點。

2.4 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll蛋白高級結構及功能分析

通過Lasergene軟件中Protean程序對疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白二級結構進行分析，結果（圖4）顯示：疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白抗原位點均分布在60～120、160～180、200～220、260～279位氨基酸，具有較好的柔韌性，前3個抗原可及性較高。由表2可知，疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白二級結構中。α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲較多，其中ORFV-PN株。α-螺旋比疫苗株多14個，β-轉角、β-折疊和無規(guī)則卷曲比疫苗株分別少3個、7個和4個。通過Swiss-Model在線軟件提交疫苗株與ORFV-PN株ORFV01l蛋白序列進行三維結構的預測，從造模結果發(fā)現(xiàn)，與磷酸酯酶D（PhosphollpaseD）結構相似性最高，與蛋白結構域預測結果相同。由圖5（箭頭所指位置）可以看出，疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白的三維結構有一定的差異，與二級結構預測結果一致，具體體現(xiàn)在無規(guī)則卷曲的程度和α-螺旋的長度上。

3 討論

疫苗接種是控制傳染病發(fā)生的有效手段之一。目前國內外對羊口瘡的預防主要是通過接種弱毒苗。然而，由于羊口瘡病毒弱毒苗接種方法的特殊性，以及各地使用疫苗免疫后效果不理想，出現(xiàn)免疫失敗和重復感染，近年來出現(xiàn)了關于羊口瘡病毒弱毒苗是否能夠提供有效保護的疑惑。

據(jù)報道，ORFVOll基因編碼約42kDa的蛋白具有良好的免疫原性，可以刺激機體產生強烈的抗體反應。此外ORFVOll基因常被用作遺傳進化樹分析，是作為羊口瘡病毒分子流行病學研究的參考對象之一。對福建省地方株和疫苗株ORFVOll基因的分子特征及蛋白結構的比較分析，可為福建省羊口瘡的診斷、流行病學調查及疫苗選擇提供理論依據(jù)，同時有助于闡明羊口瘡病毒的致病機制。

本研究通過對市面上購買的商品化羊口瘡病毒疫苗弱毒株和福建省ORFV-PN株提取DNA，利用設計的特異性引物擴增ORFVOll全基因，將擴增產物進行膠回收，轉化至基因工程菌中，將陽性克隆子送生物技術公司測序，利用生物信息學軟件對測序后的核苷酸序列和蛋白結構進行比較分析。核苷酸序列和氨基酸序列相似性比較顯示，ORFV-PN與疫苗株和弱毒株D1701株ORFVOll基因核苷酸序列相似性分別為98.6%和98.4%，氨基酸序列相似性均為98.7%，與疫苗株相比，ORFV-PN株共有16處核苷酸變異和5處氨基酸變異，該結果與李智、E1-Tholoth、ZHANG等研究結果一致。在蛋白一級結構上，疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白均有4個糖基化位點，位點未發(fā)生轉移或突變;兩者均無信號肽，表明ORFV01l為非分泌蛋白;親水性區(qū)域和理論等電點均相同，但相對分子質量卻不同，這與氨基酸的點位突變有關。在蛋白二級結構上，ORFV-PN株和疫苗株的抗原位點差異甚小，但在α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和β-折疊數(shù)量上存在一定的差異，ORFV-PN株和疫苗株。α-螺旋占比分別為34.13%和30.42%，β-轉角占比分別為6.08%和6.88%，無規(guī)則卷曲占比分別為37.3%和39.15%，β-折疊占比分別為22.49%和23.54%;蛋白三級結構上ORFV-PN株預測的三維結構與疫苗株的三維結構在α-螺旋和無規(guī)則卷曲上有一定的差異，三級結構上的差異與二級結構預測相一致。

本研究運用多種生物信息學軟件對羊口瘡病毒疫苗株和福建ORFV-PN株ORFVOll基因及編碼的蛋白在分子特征以及蛋白結構功能方面進行分析，結果顯示，福建省羊口瘡病毒已出現(xiàn)一定的變異，應當引起廣大獸醫(yī)工作者和有關部門的重視，加強對羊口瘡的監(jiān)控。