林清霞 王麗麗 楊軍國 宋振碩 陳林

摘要：[目的]研究茶葉兒茶素HPLC指紋圖譜與其自由基清除活性的關(guān)系。[方法]采用70%甲醇對綠茶、白茶、閩北烏龍、閩南烏龍、紅茶5類共25批次樣本進行提取;以福林酚法測定總酚含量;以1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法研究自由基清除活性;同時通過高效液相色譜法（HPLC）獲取指紋圖譜數(shù)據(jù)并對所獲取的指紋圖譜數(shù)據(jù)進行主成分分析;采用偏最小二乘回歸分析研究HPLC指紋圖譜與DPPH清除活性的譜效關(guān)系，結(jié)合皮爾遜（Pearson）相關(guān)性分析對偏最小二乘回歸模型進行驗證。[結(jié)果]獲取25批次樣本的HPLC指紋圖譜，確定了8個兒茶素類化合物，成功構(gòu)建了偏最小二乘回歸方程，其決定系數(shù)R²=0.9009.結(jié)果表明表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）與DPPH清除力相關(guān)性最強，均呈極顯著正相關(guān);沒食子酸（GA）與DPPH清除力呈負(fù)相關(guān)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果與偏最小二乘回歸模型結(jié)果基本一致。[結(jié)論]本研究通過HPLC指紋圖譜信息可預(yù)測抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：兒茶素;抗氧化;高效液相色譜（HPLC）;譜效關(guān)系

中圖分類號：TS272文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）02-4210-07

0 引言

（研究意義）譜效關(guān)系是中醫(yī)藥研究人員提出的一種全新的思維方式，即采用高效液相色譜（High performance uquid chromatography，

HPLC）、近紅外光譜（Near infrared spectrometry，NIR）、核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）、氣質(zhì)/液質(zhì)聯(lián)用（Gas chromatography/Liquid chromatography-Mass spectrometry，GC/LC-MS）等先進分析技術(shù)獲得樣品的化學(xué)指紋圖譜，也就是“譜”：同時采用傳統(tǒng)分析方法獲得這些樣品的活性數(shù)據(jù)，也就是“效”：將所得到的兩組數(shù)據(jù)通過合適的化學(xué)計量學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法進行數(shù)據(jù)挖掘和處理，從而建立指紋圖譜與藥效之間的關(guān)系模型。通過模型即可預(yù)測藥效大小，實現(xiàn)高通量分析，極大提高分析速度，縮短分析時間。（前人研究進展）譜效方法的提出為中藥研究解決了許多難題，中藥成分復(fù)雜，其藥效是多種成分共同作用的結(jié)果，通過譜效關(guān)系研究可以闡明具有協(xié)同作用或拮抗作用的有效成分組成，從而揭示藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。徐晶晶等通過譜效關(guān)系研究，篩選出薄荷藥材中發(fā)揮抗氧化活性的化學(xué)成分群，為合理確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)起到了積極作用。中藥藥效基礎(chǔ)為多成分共同作用，而每個成分對藥效貢獻度不一致。Zhu等通過譜效關(guān)系研究，確定了各化合物的活性貢獻度的大小順序，從而闡明了有效成分的組成、數(shù)目和對集體的作用程度。Xu等指出，譜效關(guān)系的研究能夠反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的效果指紋，可以通過化學(xué)指紋圖譜來評估中藥質(zhì)量。（本研究切入點）茶葉與中藥類似，內(nèi)含成分復(fù)雜，其抗氧化活性亦是多成分共同作用的結(jié)果，傳統(tǒng)的茶葉抗氧化活性檢測方法，如1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical 2，2-D真phenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid），ABTS]、鐵離子還原航氧化力測定法（Ferricreducinz/antioxidant power assay，F(xiàn)RAP）等只能檢測茶葉的總抗氧化能力，無法確定各成分對抗氧化活性的貢獻度，只有先經(jīng)過提取、分離、鑒定后再分別對各成分進行抗氧化活性測定。對單一組分的抗氧化成分進行提取、分離易導(dǎo)致其活性的改變，無法準(zhǔn)確評價其抗氧化能力，且傳統(tǒng)測定方法耗時費力。茶多酚是茶葉中最主要的抗氧化活性成分，其中兒茶素類約占茶多酚總量的60%～80%。（擬解決的關(guān)鍵問題）本研究采用DPPH法對茶葉的抗氧化活性與其兒茶素類HPLC指紋圖譜進行譜效學(xué)分析，探討其圖譜特征峰抗氧化活性大小并建立模型，以期通過譜效模型預(yù)測茶葉兒茶素的抗氧化活性，實現(xiàn)茶葉抗氧化活性的快速分析。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備

供試材料：從市場購得不同類別茶葉樣本共計30批次，25批次作為訓(xùn)練集用于建模，具體構(gòu)成為：5批次綠茶（Gl、G2、G3、G4、G5），5批次白茶（W1、W2、W3、W4、W5），5批次閩北烏龍（N1、N2、N3、N4、N5），5批次閩南烏龍（S1、S2、S3、S4、S5），5批次紅茶（Bl、B2、B3、B4、B5），另外5批次茶樣（Rl、R2、R3、R4、R5）作為測試集對回歸模型進行外部檢驗。從訓(xùn)練集中隨機抽取5批次（Gl、B3、N4、W3、S5）對回歸模型進行內(nèi)部驗證。

主要試劑：沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）、兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate，CG），上述兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品純度均>98%，美國Sigma公司;沒食子酸（Gallic acid，GA，分析純），生工生物工程（上海）股份有限公司;甲醇（色譜純），Sigma-Aldrich;甲酸溶液[含量49%-51%（T），色譜純，F(xiàn)luka;DPPH（純度>97%），京東化成工業(yè)株式會社;無水乙醇和甲醇（分析純），上海國藥。

主要儀器設(shè)備：美國Agilent 1260型液相色譜系統(tǒng)，包括四元泵（G1311CVL）、標(biāo)準(zhǔn)自動進樣器（G1329B）、柱溫箱（G1316A）和二極管陣列檢測器（G1315DVL）;CD-0502-U實驗室超純水系統(tǒng)，重慶艾科浦;HWs.28電熱恒溫水浴鍋，上海恒科;VARIOSKAN LUX酶標(biāo)儀，美國Thermo SCIENTIFIC公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用。

1.2 試驗方法

1.2.1茶葉多酚總量的測定 茶多酚（Teap01yphenols，TPs）總量：參照GB/T8313-2018，采用福林酚（Folin-Ciocalteu）法測定。

1.2.2茶葉DPPH自由基清除率測定DPPH溶液的配制：精密稱取DPPH適量，加無水乙醇溶解配成0.1mmol·L^-1的DPPH溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。茶樣提取方法采用GB/T 8313-2018，用純水稀釋100倍后即為茶樣測試液，用于DPPH自由基清除試驗，限當(dāng)日使用。

試驗發(fā)現(xiàn)茶樣測試液添加量為180uL時，各茶樣清除濃度均在其線性范圍內(nèi)，即取茶樣測試液180uL，加純水1.82mL，再加0.1mmol·L^-1的DPPH溶液2mL，測定比較25個茶樣對DPPH自由基的清除活性。

1.2.3茶葉HPLC指紋圖譜采集采用TSKgelODS-IOOZ色譜柱（4.6mm×150mm，5um，日本Tosoh公司），以0.1%甲酸水溶液（A相，v/v）和甲醇（B相）為流動相，洗脫方式為83%A（0min）-75%A（5min）-73%A（7min）-58%A（16min）-83%A（18min），柱溫40℃，流速1.0mL-min，檢測波長280nm.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用ChemPattern 2017對供試樣品的HPLC化學(xué)指紋圖譜進行分析;采用Origin 8.5對總酚含量和DPPH清除活性數(shù)據(jù)進行處理;采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉多酚總量與DPPH清除活性關(guān)系

為確保參與建模的DPPH數(shù)據(jù)有效，本研究探討了TPs與DPPH清除活性關(guān)系，見圖1.總體來看，TPs與DPPH清除活性呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)分析顯示TPs與DPPH清除率相關(guān)系數(shù)為0.874，這與文獻報道DPPH清除能力與TPs之間呈顯著正相關(guān)的結(jié)果一致。綠茶、白茶的TPs在各類茶中含量最高，烏龍茶次之，紅茶最低，DPPH清除能力大小變化趨勢與TPs一致，與文獻報道相同。這可能是由于綠茶屬不發(fā)酵茶，白茶發(fā)酵程度較低，TPs含量高，均很大程度保留了鮮葉中的功效成分;烏龍茶屬半發(fā)酵茶，紅茶屬全發(fā)酵茶，發(fā)酵程度越高，TPs氧化程度越高。這一結(jié)果驗證了DPPH清除活性數(shù)據(jù)的有效性。

2.2 兒茶素類HPLC指紋圖譜與DPPH清除活性關(guān)系

2.2.1HPLC指紋圖譜的主成分分析 HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)是參與建模的另一組數(shù)據(jù)，采用Chempattem2017軟件對25個樣品的HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)進行主成分分析。從圖2可以看出第l主成分（PCI）和第2主成分（PC2）分別解釋了各色譜峰總變異的66.28%和29.66%，累計方差總變異貢獻度達(dá)95.94%。各茶類存在明顯的類群區(qū)分，綠茶、白茶、烏龍茶、紅茶從左向右偏移，這可能是因為各類茶制作工藝不同，其活性化學(xué)成分和含量也不同。綠茶屬不發(fā)酵茶、白茶屬輕發(fā)酵茶，二者相距較近;烏龍茶屬半發(fā)酵茶，居中;紅茶屬全發(fā)酵茶，右移最多;即發(fā)酵程度越重，右移越多。本研究所選用的樣品為綠茶、白茶、閩北烏龍、閩南烏龍、紅茶5類茶樣，這5類茶樣的HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)的主成分分析亦成功劃分為5個類群，并按發(fā)酵程度有序偏移，這在一定程度驗證了HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)的有效性。

2.2.2基于偏最小二乘法的兒茶素類抗氧化譜效關(guān)系采用Chempattern 2017對HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)進行處理。圖3為25個樣品的HPLC指紋圖譜疊加圖。以GA、GC、EGC、EGCG、EC、GCG、ECG、CG作為研究對象，以其峰面積參與構(gòu)建模型，各化合物峰面積數(shù)據(jù)見表1.分析前對8個化合物的峰面積數(shù)據(jù)進行Auto-scaling預(yù)處理，處理后的量綱數(shù)據(jù)與DPPH清除率建立偏最小二乘回歸。以峰面積為自變量（X），抗氧化活性數(shù)據(jù)為因變量（Y），建立偏最小二乘回歸方程，Y=48.4264-1.0387X_GA+0.8351X_GC+3-2989X[_EGC2.5719X_EGCG-1.0467X_EC+1.2953X_GCG+1.9433X_ECG+0.1999X_CG，決定系數(shù)R²=0.9009，潛變量數(shù)保留3個（潛變量數(shù)的選擇會影響模型X的解釋率以及模型Y的預(yù)測率，當(dāng)潛變量數(shù)保留3個，模型對X的解釋率以及Y的預(yù)測率最優(yōu)），模型X累積解釋率R²X達(dá)87.85%，模型Y預(yù)測率Q2²Y達(dá)86.32%。方程回歸系數(shù)的符號確定色譜峰與活性指標(biāo)的相關(guān)變化方向（即正、負(fù)相關(guān)），回歸系數(shù)的大小確定色譜峰對活性指標(biāo)的重要程度。由此可知，EGC、EGCG、ECG與DPPH清除力相關(guān)性最強，均呈正相關(guān);GA與DPPH清除力呈負(fù)相關(guān)。對回歸方程進行假設(shè)檢驗（假設(shè)H₀=數(shù)據(jù)間不存在顯著線性回歸關(guān)系），其結(jié)果見表2.按顯著性水平α=0.05，數(shù)據(jù)間存在顯著線性回歸關(guān)系。內(nèi)部檢驗以及外部驗證結(jié)果見表3，內(nèi)部檢驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.62%，外部驗證的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10.97%。由此可以看出，利用HPLC指紋圖譜和抗氧化數(shù)據(jù)構(gòu)建茶樣的譜效關(guān)系具有一定的實用價值。

多種統(tǒng)計方法并用能夠更加詳盡解釋譜效關(guān)系，亦可達(dá)到相互佐證效果。本研究采用SPSS19.0軟件對8個化合物的峰面積與其對應(yīng)的DPPH清除率數(shù)據(jù)進行雙變量相關(guān)性分析，顯著性檢驗采用雙側(cè)檢驗（T），相關(guān)系數(shù)選擇Pearson.8個化合物與DPPH清除力的相關(guān)性如表4所示，對清除自由基貢獻度排名前三的化合物為EGCG、EGC、ECG，三者與其DPPH清除力均呈極顯著正相關(guān)，GA與DPPH清除力呈極顯著負(fù)相關(guān)，這與偏最小二乘回歸方程結(jié)果基本一致。

3 討論

合理的數(shù)據(jù)處理是譜效關(guān)系研究的核心。茶葉內(nèi)含成分復(fù)雜，各成分存在多重相關(guān)性，偏最小二乘回歸分析法集主成分分析、多元線性回歸分析、典型相關(guān)分析于一體，能夠在自變量存在多重相關(guān)情況下進行回歸建模，適用于本研究。建立譜效關(guān)系所采用的各種化學(xué)計量學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法都存在一定的局限性，這要求我們多種統(tǒng)計方法并用，能夠更加準(zhǔn)確地解釋譜效關(guān)系。偏最小二乘回歸分析法是基于觀測數(shù)據(jù)建立變量之間某種依賴關(guān)系，尋找內(nèi)在規(guī)律并用于預(yù)測控制的一種統(tǒng)計方法，能夠反應(yīng)各個色譜峰對應(yīng)成分對活性指標(biāo)的綜合作用效果。Pearson相關(guān)分析可研究連續(xù)變量之間的相關(guān)性，反映2個或多個變量之間相關(guān)程度與方向，可通過相關(guān)系數(shù)評價其相關(guān)性，能獨立算出每一個色譜峰對活性的影響。因此，本研究選用偏最小二乘回歸分析對25個茶葉的指紋圖譜以及茶葉的DPPH清除活性這兩組數(shù)據(jù)進行解析，并引入Pearson相關(guān)分析對偏最小二乘回歸模型進行驗證。

茶多酚是茶葉的主要活性成分，是茶葉品質(zhì)及生物學(xué)活性評價的主要指標(biāo)，茶葉抗氧化活性與茶多酚含量密切相關(guān)。兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，約占茶多酚總量的60%～80%，因此茶葉的抗氧化活性可用兒茶素進行評價。本研究以GA、GC、EGC、EGCG、EC、GCG、ECG、CG為試驗對象，以其峰面積為自變量（X），抗氧化活性數(shù)據(jù)為因變量（Y），成功構(gòu)建偏最小二乘回歸方程為卜48.4264-1.0387X_GA+0.8351ZX_GC+3.2989X_EGC+2.5719X_EGCG-1.0467X_EC+1.2953X_GCG+1.9433X_ECG+0.1999X_CG，決定系數(shù)R²=0.9009.偏最小二乘回歸分析與Pearson分析結(jié)果一致，說明EGCG、EGC、ECG與DPPH清除力相關(guān)性最強，且呈正相關(guān);GA與DPPH清除力呈負(fù)相關(guān)，對模型進行外部檢驗和內(nèi)部檢驗，所構(gòu)建模型的平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.58%，這說明利用兒茶素HPLC指紋圖譜與其抗氧化數(shù)據(jù)構(gòu)建的譜效關(guān)系模型具有一定的實用價值，有望通過兒茶素HPLC指紋圖譜信息預(yù)測其抗氧化活性，初步實現(xiàn)兒茶素抗氧化活性的高通量分析。

GA本身具有較強的抗氧化活性，盧怡雯等以GA單體進行研究，發(fā)現(xiàn)GA含量與DPPH清除活性呈正相關(guān)，且存在良好的線性劑量效應(yīng)關(guān)系。馬慧等以茶葉提取物評估其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)茶葉提取物中GA含量與DPPH清除活性的相關(guān)性為-0.71，與本研究結(jié)果一致，這可能是因為茶葉的抗氧化活性是各成分共同作用的結(jié)果，單一成分的含量及其活性指標(biāo)不能真實反應(yīng)茶葉的內(nèi)在質(zhì)量，發(fā)酵茶總體上抗氧化活性低于不發(fā)酵茶或半發(fā)酵茶，然而發(fā)酵茶中GA含量高于不發(fā)酵茶或半發(fā)酵茶。紅茶抗氧化活性最弱，總酚含量最少，而GA含量最高;白茶、綠茶抗氧化活性強，總酚含量高，GA含量低。綜上所述，茶葉中GA不是主要抗氧化活性成分，GA含量的變化不能主導(dǎo)抗氧化活性的變化，而總酚含量增減對抗氧化活性強弱有著決定性作用。