鄭世仲 王培育 張春柳 江勝滔 江金蘭 顏沛沛 葉煒 賴鐘雄

摘要：[目的]探明文心蘭NPRl基因在誘導抗性過程中的生理作用。[方法]利用RACE技術克隆文心蘭NPRl基因全長，并進行相關生物信息學分析和遺傳進化樹的構建;以印度梨形孢共培養(yǎng)、水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）處理文心蘭，分析菊歐文氏桿菌導致的軟腐病抗性影響及NPRl基因的表達特性變化。[結果]克隆得到的2條基因序列長度分別為l 804bp和l 902bp，編碼555、556個氨基酸，均為NPRl類型，分別命名為OgNPRl-1和OgNPRl-2;文心蘭兩個NPRl基因在未接菌的情況下均呈現低表達量，在接種共生菌印度梨形孢后輕微上調表達，在接種菊歐文氏桿菌后顯著上調表達，而在印度梨形孢共生菌的存在下，接種菊歐文氏桿菌使兩個NPRl基因表達更為活躍;同時，相比印度梨形孢共生菌處理，兩個NPRl基因均在外源SA、MeJA處理下接種菊歐文氏桿菌表現為更顯著上調表達;此外，共生印度梨形孢可顯著提高文心蘭對菊歐文氏桿菌導致軟腐病的抗性，限制軟腐病病癥在非接病葉片的擴展。[結論]在共生印度梨形孢的文心蘭植株中，印度梨形孢顯著提高了文心蘭NPRl基因響應菊歐文氏桿菌的表達水平，雖然上調水平不及SA和MeJA激素處理的水平，卻使文心蘭植株表現出更強的對抗軟腐病的能力。

關鍵詞：文心蘭;NPRl;誘導性抗性;印度梨形孢;菊歐文氏桿菌

中圖分類號：S 682.31文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）02-0140-10

0 引言

（研究意義）在植物中，系統性抗病機理存在兩種產生類型，一種是由致病菌及其特征物誘導的系統獲得性抗性（Systemic acquiredresistance，SAR），另一種為系統誘導性抗性（Induced systemic resistance，ISR），主要由非致病性根際微生物所誘導。早期認為，ISR的產生可能依賴于谷胱甘肽一抗壞血酸循環(huán)的抗氧化能力的激活，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）途徑相關基因的表達可能在ISR產生中起重要作用，并且在ISR形成過程中，防御基因（Defensegene）及水楊酸（Salicylic acid，SA）信號途徑相關基因被大量抑制。近年來，相關研究已經表明ISR形成及作用過程可能存在更為復雜的機制，SA信號途徑相關基因在ISR病原菌入侵初期大量表達，并在其后的系統性抗性誘導中扮演重要角色。（前人研究進展）非表達病程相關蛋白（Non-expresserofpathogenesis related genes l，NPRl）充當植物防御信號的主要調節(jié)因子，廣泛參與植物的防御反應。NPRl是一種SAR的正調控因子，植物傾向于連續(xù)地誘導NPRl及SA信號途徑相關基因的表達進而啟動防御基因表達，當誘導SAR后，NPRl易位至細胞核，接著與基本結構域/Leu拉鏈（bZIP）轉錄因子的TGA/OBF亞類成員相互作用，參與SA依賴性病程蛋白相關基因（Pathogenesis related genes，PR）的激活。NPRl同樣在ISR中起重要作用，與SAR相反，雖然ISR不依賴于SA的積累，但JA不能在擬南芥（Arabidosis thaliana）NPRl突變株中誘導ISR，表明JA誘導的ISR的啟動同樣依賴于NPRl的作用。NPRl參與植株體內SA與JA的平衡，在SA的存在下，NPRl參與抑制包括LOX2、VSP和PDFl.2mRNA水平的積累，是JA信號途徑的負調控因子;同時，NPRl又能抑制SA的從頭合成，提高JA信號途徑防御基因的表達。

文心蘭是我國特別是臺灣地區(qū)最主要的出口切花品種，極易受到軟腐病侵害，其病原物主要為歐文氏桿菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）與菊歐文氏桿菌（e.chrysanthemi，Pectobacteriumchrysanthemisyn，Dickya dadantii syn.nov.）。菊歐文氏桿菌寄主范圍廣泛，還未見具有其抗性的蘭花種質被報道。印度梨形孢（Piriformospora indica）可為多種物種帶來系統性抗性，提高植株對抗病害的能力。在此前的試驗中發(fā)現印度梨形孢可以提高文心蘭系統性對抗軟腐病的能力，并且植株體內SA、JA水平也在接種印度梨形孢后顯著提高，利用此前完成的轉錄組（PRJNA428913）分析發(fā)現文心蘭根部有兩個注釋為NPRl的基因片段。（本研究切人點）目前，蘭科植物中僅見關于蝴蝶蘭（Phalaenopsisaphrodite subsp.formosana）NPRl基因克隆分析的相關報道，而不同物種NPRl基因的功能存在差異。（擬解決的關鍵問題）為了解文心蘭NPRl基因在ISR過程中的生理作用，本試驗通過克隆文心蘭NPRl基因全長，分析其所屬類型及在印度梨形孢誘導的ISR過程中的表達情況，以期為揭示文心蘭抗軟腐病分子機理及抗性育種提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

文心蘭南茜組培苗、菊歐文氏桿菌由三明市農業(yè)科學研究院建立并保存，其培養(yǎng)及繼代參照江金蘭等的方法及楊學等的方法。印度梨形孢由臺北大學葉開溫饋贈并保存于三明市農業(yè)科學研究院，其培養(yǎng)及接種文心蘭植株參照葉煒等的方法。利用Trizol法（Invitrogen）抽提文心蘭RNA并于-80℃保存?zhèn)溆?，RLM-RACE試劑盒獲得cDNA全長于-20℃保存?zhèn)溆谩rimeScript RT reagent Kit withgDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，RR047A）獲得cDNA用于實時定量PCR（Real-time QuantitativePCR，qPCR）。

1.2NPRl基因全長克隆及分析

利用pfam（pfam.xfam.org）下載NPRl/NIMl liksdefenceprotein C terminal種子文件（PFl2313），于轉錄組數據（PRJNA428913）進行隱馬克夫模型（Hidden Markov models，HMMs）搜索，并利用所得到片段進行RACE擴增全長，設計開放閱讀框（Open reading frame，ORF）的引物進行全長驗證，所用引物見表1.RACE及ORF擴增使用2×TaqPCRMastermix（天根，KT201），參照說明書及引物溫度進行PCR反應，陽性條帶回收TA克隆后轉化大腸桿菌，送博尚基因測序。利用DNAMAN 6.0進行蛋白序列預測，NCBI BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行核酸及蛋白序列比對。利用NCBICD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行保守結構域分析。利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽分析。利用PSORT（https：//psort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預測。

1.3NPRl進化樹分析

所獲得OgNPRl-1、OgNPRl-2蛋白序列與擬南芥及其他物種NPRl及近似蛋白序列構建Neghbo～Joining進化樹，構建進化樹軟件為MEGA10.1，設置bootstrap=1000.擬南芥AtNPRl（A了1G64280）、AtNPR2（AT4G26120）AtNPR3（AT5G45110）AtNPR4（AT4G19660）、AtBOPl（AT3G57130）、AtBOP2（AT2G41370）下載自TAIR，其他物種NPRl及其近似序列包括葡萄（Vitis vinifera）VvNPRl.2（XP002274045入甜菜（Jetavulgaris）BvNIMl（AAT57640人大豆（Glycine max）GmNPRl-1（NP 001238658）、GmNPRl-2（NP 001238674）、煙草（Nicofianatabacum）NtNPRl（ABH04326）、可可（Rheobromacacao）TcNPRl（ADl24348）、白毛果楊（Populustrichocarpa）PtNPRl（XP 002308281）、PtNPR2（XP 002322351）、PtNPR4（XP 002307566）、PtBOPl（XP 002323261）、PtBOP2（XP 002308905）、秈稻（Oryzae sativa Indica Group）OsNPRl/NHl（AAXl8700）、粳稻（OryzasativaeJaponicaGroup）OsNPRl（AAP92751）、OsBOP2（ABEl 1621）、小果野蕉（Musa acuminata AAA Group）MaNPRl-B（ABl93182）、MaNPRl-A（ABL63913）、高粱（Sorghumbicolor）SbNPRl（XP 002455011）、SbNPR2（XP0024641lo）、SbNPR3（XP 002456404）、SbBOPl（XP002442682）、SbBOP2（XP 002450246）、湖北海棠（Malus hupehensis）MhNPRl（ADP95762）下載自NCBI GenBank.

1.4NPRl基因表達分析

利用與印度梨形孢共培養(yǎng)10d后的文心蘭組培苗（P），取每個植株第二片葉進行菊歐文氏桿菌接種試驗，以接種水的文心蘭為對照（CK），接菌24h后，收集接種部位葉片（PEL）和鄰近接種葉片（PED），對照文心蘭也收集相應的部位葉片（EL）和鄰近接種葉片（ED）提取RNa.為了解NPRl在SA和JA信號下表達情況，利用1.0mmol·L^-1SA溶液，0.1mmol·L^-1茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）溶液噴灑文心蘭葉片，24h后收集提取RNa.利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（PerfectRealTime）試劑盒（Takara，RR047A）合成cDNa.以Act&為內參進行ABI QuantStudio 3熒光定量PCR儀進行定量分析。利用Premix Ex Taq Ⅱ試劑（TAKARA，RR820A）參照說明書及引物溫度進行擴增反應。每個試驗以5株為一個處理，試驗3個獨立重復，利用DPS7.05進行鄧肯氏新復極差檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 文心蘭NPRl基因的克隆與生物信息學分析

利用HMMER從轉錄組數據庫獲得l條編號為Pl comig 4467序列，序列長度為1238bp.NCBIBlast比對顯示該蛋白序列與蝴蝶蘭NPRl蛋白序列（AEP68016.1、XP 020587799.1）有83.53%、83.28%的一致性，具有NPRl likeC（pfaml2313）結構域，表明該序列為NPRl基因。根據Pl contig 4467序列設計RACE引物（表1），經序列拼接，分別獲得兩條長度為1804、1902bp核酸序列，ORF分別為1668、1665bp，編碼556、555個氨基酸，與ORF引物擴增驗證一致。SignalP分析顯示，兩條序列均不含有信號肽。PSORT亞細胞定位預測為OgNPRl-1：質膜60%，高爾基體40%，線粒體內膜34.6%，內質網膜30%;OgNPRl-2：質膜65%，線粒體內膜34.6%，內質網膜20%，葉綠體片層膜17.3%。

通過NCBI保守結構域分析兩條推斷蛋白序列表明，2條推斷蛋白序列均含有BTB POZ NPRplant（pfam00651）、DUF3420（pfaml 1900）、Ank 2（pfam12796）、NPRl like C結構域。NBCIBlast結果顯示2條推斷蛋白序列與來自蝴蝶蘭的NPRl蛋白序列有較高一致性（表2）。利用DNAMAN 6.0將其與蝴蝶蘭、擬南芥的NPRl蛋白序列進行多重序列比對，呈現較高的保守性，并且與擬南芥NPRl蛋白序列Cvs⁸²和Cys²¹⁶位點一致（圖1）。2條序列分別命名為NPRl isoform Xl（OgNPRl-1）、NPRl isoform Xl（OgNPRl-2），序列登錄號分別為MN402677、MN402678.

2.2 文心蘭NPRl進化樹分析

由于NPRl及近似基因具有不同的生理功能，利用其他物種已知的NPRl、近似蛋白序列與OgNPRl-l、OgNPRl-2構建進化樹，結果表明進化樹分析與BLAST結果一致（圖2）。文心蘭2個NPRl蛋白與蝴蝶蘭、小果野蕉、水稻最為接近，與擬南芥NPRl、NPR2一起被聚類在NPRl類型。NPR3類群與BOP類群序列與預期一致，再次表明所分離的文心蘭OgNPRl基因為NPRl類型。