姜身飛 謝云杰 李樂樂 王昱澎 蔡秋華 謝華安 張建福

摘要：[目的]制備特異性O(shè)sDUF6多克隆抗體，為深入研究OsDUF6在水稻中的生理生化功能提供強(qiáng)有力的工具，為在分子水平上揭示其作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。[方法]通過對OsDUF6基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從中選取3段不同區(qū)域的氨基酸序列作為抗原，用于抗體制備。用Tetras多通道多肽合成儀合成短肽并用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行蛋白質(zhì)純度檢測;免疫新西蘭雄性大白兔，制備相應(yīng)的多克隆抗體。通過間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測多克隆抗體效價，通過構(gòu)建OsDUF6的原核表達(dá)載體檢測多克隆抗體的特異性，最后利用轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)一步檢測抗體。[結(jié)果]利用高效液相色譜法（HPLC）檢測3條合成的短肽（蛋白純度>85%）用于免疫新西蘭雄性大白兔，得到效價為1：512000的3種多克隆抗體。構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX6p-1-DUF6，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白GST-OsDUF6，并用GST單克隆抗體成功檢測到重組蛋白。在此基礎(chǔ)上，對制備的抗體進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Anti-DUF6-1多克隆抗體結(jié)合重組蛋白GST-DUF6的特異性最高。選取該抗體作進(jìn)一步驗證，以非轉(zhuǎn)基因植株作為對照，通過提取DUF6過表達(dá)水稻植物總蛋白進(jìn)行抗體檢測，結(jié)果表明，Anti-DUF6-1能識別OsDUF6蛋白特異條帶，并且在過表達(dá)植株中顯示較高的蛋白豐度。[結(jié)論]制備的Anti-DUF6-1多克隆抗體能特異性識別水稻未知功能域蛋白OsDUF6，可用于該蛋白的進(jìn)一步功能研究。

關(guān)鍵詞：OsDUF6;多克隆抗體;原核表達(dá);轉(zhuǎn)基因水稻

中圖分類號：S511文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）02-0117-07

0 引言

（研究意義）近年來，未知功能結(jié)構(gòu)域蛋白家族（Domains of ullknown function protein families，DUFs）是科研工作者的研究熱點，它是一大群未知功能和沒有注釋的蛋白家族，其蛋白數(shù)量占整個蛋白家族的25%左右。此外，它還和一些有命名但是還沒有注釋功能的蛋白家族，統(tǒng)稱為DUFs.21世紀(jì)以來，越來越多的報道發(fā)現(xiàn)，DUFs在植物整個生命歷程中發(fā)揮著重要作用，因此研究該類基因的生物學(xué)功能具有重要意義。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，蛋白水平上的研究已經(jīng)備受關(guān)注，研究基因的功能不再局限于轉(zhuǎn)錄水平?？贵w制備是在蛋白水平上研究基因功能的重要環(huán)節(jié)，制備高效價的抗體是研究基因功能的前提。（前人研究進(jìn)展）DUFs普遍存在于生物中，其中在真核生物中約占20%。近年來，已有研究表明，DUFs廣泛存在于植物中，如DUF640、DUF579等。研究發(fā)現(xiàn)，DUFs參與植物體內(nèi)一些重要的生物學(xué)過程，發(fā)揮一系列的生理功能。DUFs可以參與調(diào)控植物生長發(fā)育，其中水稻DUF266家族的糖基轉(zhuǎn)移酶基因BC10與糖基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記基因GTs，共同參與植物細(xì)胞壁形成發(fā)育的生理機(jī)制。DUFs也調(diào)控植物對病害的防御反應(yīng)，例如Kim等對稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）進(jìn)行蛋白質(zhì)組差異分析發(fā)現(xiàn)，5個DUF26稻瘟病響應(yīng)蛋白參與水稻對稻瘟病的防御反應(yīng);李娟等通過構(gòu)建水稻DUF500家族基因OsDUF500的沉默株系，發(fā)現(xiàn)其與野生型相比表現(xiàn)出較高的水稻白葉枯病抗性，說明該基因可能對水稻白葉枯病抗性起負(fù)調(diào)控作用。DUFs還參與調(diào)控植物對非生物脅迫的響應(yīng)，已報道水稻DUF966家族基因OsDSR2和OsDSR4基因參與水稻對干旱和鹽脅迫的響應(yīng)。因此，DUFs家族在植物生長發(fā)育各個階段中充當(dāng)多種角色，研究DUFs基因功能有助于了解植物體內(nèi)復(fù)雜的分子機(jī)制。伴隨著分子生物學(xué)的理論不斷發(fā)展以及相關(guān)生物技術(shù)的日趨成熟，研究基因在蛋白水平上的功能，通常利用純化重組蛋白制備多克隆抗體。該技術(shù)不僅在動物中廣泛應(yīng)用而且在植物研究中也成為一種重要手段。例如，為研究水稻PDK2基因在能量代謝的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制，譚才鄧等通過構(gòu)建PDK2的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中高效表達(dá)獲得重組蛋白，進(jìn)一步純化免疫家兔制備得到PDK2多克隆抗體，為研究PDK2的表達(dá)模式及其互作蛋白奠定基礎(chǔ);有研究表明CSN5可以調(diào)控植物的生長發(fā)育，但是目前對其功能的研究較少，因此何龍等在克隆該基因的基礎(chǔ)上，利用原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)該蛋白并純化，制備該蛋白的特異性抗體，有利于該基因的深入分析研究?？贵w已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物研究中，如進(jìn)行內(nèi)源蛋白的表達(dá)分析、蛋白的體外互作驗證等，抗體制備也成為研究基因必不可少的環(huán)節(jié)。（本研究切入點）水稻為重要的模式植物，但是有關(guān)其DUFs家族基因的報道中僅有少數(shù)基因被揭示了生物學(xué)功能，而大部分家族基因尚未進(jìn)行功能研究。水稻DUFs家族基因OsDUF6目前尚未有報道研究其生物學(xué)功能。（擬解決的關(guān)鍵問題）本研究通過對OsDUF6生物信息學(xué)分析，從中選取3段不同的氨基酸序列，合成短肽后免疫新西蘭大白兔制備相應(yīng)的多克隆抗體，并構(gòu)建OsDU6的原核表達(dá)載體來檢測多克隆抗體的特異性，旨在研究OsDUF6在水稻生長發(fā)育過程中的生理生化功能，并在蛋白水平上研究OsDUF6基因功能，為揭示其作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1材料

pGEX6p=1原核表達(dá)載體由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻國家工程實驗室保存，大腸桿菌Transl-Tl購自北京全式金公司，大腸桿菌Rosetta購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)基因植株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻國家工程實驗室提供。所用的動物材料為雄性新西蘭大白兔、秈稻品種75-1-127、轉(zhuǎn)基因過表達(dá)水稻植株。

1.1.2試劑與設(shè)備 試劑：十二烷基磺酸鈉（Sodiumdodecyl sulonate，SDS）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、氨芐青霉素、考馬斯亮藍(lán)R-250、低分子量蛋白預(yù)染Maker購自賽默飛世爾科技有限公司;辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的羊抗兔IgG、GST單克隆抗體、DNA擴(kuò)增的高保真酶Primer Star購自TAKARA公司。DNA回收試劑盒以及質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司。PCR引物由白鯨生物有限公司合成。測序由福州鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

儀器設(shè)備：臺式冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀與電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀、Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)、Tetras多通道多肽合成儀。

1.2 試驗方法

1.2.1抗原表位分析及短肽合成 應(yīng)用DNAStarProtean軟件提供的抗原指數(shù)分析模塊Jameson-Wolf的方法對OsDUF6蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測分析，采用DNAStar Protean軟件Kyke-Doolittle的方法對OsDUF6蛋白的親水性進(jìn)行預(yù)測分析。綜合分析OsDUF6蛋白抗原表位及親水性的預(yù)測結(jié)果，從中選取3段不同區(qū)域的氨基酸序列，用Tetras多通道多肽合成儀合成氨基酸序列，并用高效液相色譜法（HPLC）對3條短肽進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的檢測。

1.2.2多克隆抗體制備及抗體效價檢測 采購的新西蘭大白兔先靜養(yǎng)36d，免疫前靜脈取血3mL，室溫靜止2-3h，4℃放置3-4h，6000r·min^-1離心15min，離心后取上清，作為陰性對照。取2mL的蛋白（0.5mg·mL^-1）與等量的弗式不完全佐劑充分乳化后免疫新西蘭大白兔，以后每隔l周進(jìn)行免疫，免疫3-4次。最后1次免疫前少量采血，通過間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進(jìn)行血清效價檢測，檢測達(dá)到預(yù)期后采取新西蘭大白兔的全部血液，取血清分裝，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3原核表達(dá)載體pGEX6p-1-DUF6檢測抗體的特異性

（1）原核表達(dá)載體pGEX6p-1-DUF6的構(gòu)建

以O(shè)sDUF6-6P-1-F（5'-CCCCTGGGATCCCCG旦AATTCATGGCCGCCTCCGGCTCCGCC-3.，酶切位點EcoR I）、OsDUF6-6P-1-R（5-GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTCATTTTGCCTTCCTTGGCC-3.，酶切位點Xho I）為引物，以水稻品種75-1-127的cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增并純化回收得到目的基因片段，用EcoRI和Xho I酶切目的片段和pGEX6p-1載體，同源重組到原核表達(dá)載體pGEX6p-1中，同時轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transl-T1.挑取單菌落，測序正確后，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta進(jìn)行蛋白表達(dá)。

（2）OsDUF6蛋白的原核表達(dá)、純化

挑一個單克隆接種于3mL LB（含Amp+）培養(yǎng)基中活化搖菌至OD_600mm=0.6，然后以1：100的比例將活化的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入新的含Amp+的液體LB培養(yǎng)基中以擴(kuò)繁菌體，待菌液OD_600mm=0.6-0.8時，加入IPTG后繼續(xù)誘導(dǎo)，對照組不加IPTG作為陰性對照。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體細(xì)胞并超聲破碎，取50uL蛋白樣品與等體積2×SDS上樣緩沖液混勻，100℃煮沸10min，冷卻后上樣進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳并利用考馬斯亮藍(lán)染色液染色進(jìn)行觀察。

擴(kuò)大體積，用上述的方法誘導(dǎo)重組蛋白，超聲破碎后收集上清。將Glutathione SepharoseTM 4B加入到結(jié)合柱中，加入PBS緩沖液漂洗樹脂3次;將誘導(dǎo)破碎后的上清加入到結(jié)合柱中。4℃，70r·min^-1搖動結(jié)合23h，用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗樹脂3次，洗脫非特異結(jié)合的雜蛋白，然后用還原性谷胱甘肽緩沖液洗脫目的蛋白。取50uL洗脫后的蛋白樣品與等體積2×SDS上樣緩沖液混勻，100℃煮沸10min，冷卻后上樣進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，并利用考馬斯亮藍(lán)染色液染色進(jìn)行觀察。

各取50uL誘導(dǎo)破碎后和純化后的蛋白樣品與等體積2×SDS上樣緩沖液混勻，100℃煮沸10min，冷卻后上樣進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在封閉液（5%脫脂奶粉的PBS緩沖液）中室溫封閉2h.加入以封閉液稀釋的抗體（GST抗體稀釋度為1：5000，自制多克隆抗體稀釋度為1：500），室溫孵育1h，再用PBST洗滌3次，每次5min.然后用PBS稀釋（稀釋度1：10000）過的HPR羊抗兔二抗，室溫孵育1h，PBST洗滌3次，每次5min.用ELC試劑進(jìn)行化學(xué)顯色并在Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)中拍照檢測。

1.2.4植物總蛋白的提取及Western blotting檢測將0.6g樣品（根）置于預(yù)冷的研缽中，用液氮研磨成粉末，加入1.5mL蛋白抽提液磨成勻漿，4℃，12000g離心20min，取上清轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，放液氮中速凍隨后放-20℃，10min，取出放冰上至溶液融化開。4℃，12000g離心20min，取上清轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中-80℃冷凍保存。取50uL蛋白樣品與等體積2XSDS上樣緩沖液混勻，100℃煮沸10min，冷卻后上樣進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行Westemblotting分析，具體步驟參考上述方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsDUF6抗原表位分析及合成短肽

利用DNAStar軟件對該蛋白序列進(jìn)行蛋白抗原表位以及親水性預(yù)測。通過DNAStar Protean軟件的Jameson-Wolf方法對OsDUF6蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，OsDUF6蛋白存在多個潛在的抗原表位，可能的蛋白質(zhì)抗原表位區(qū)域（圖1）：1-24aa、39-48aa、58-106aa、112-135aa、140-157aa、164-184aa、193-204aa、218-299aa、313-302aa、373-389aa、409--500aa.根據(jù)Kyke-Doolittle的方法對OsDUF6蛋白的親水性進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)OsDUF6蛋白具有較高的親水性，如：11-25aa、55-109aa、124-135aa、200-256aa、263-299aa、319-361aa、371-388aa、413-500aa（圖2）。綜合分析OsDUF6蛋白抗原表位及親水性的預(yù)測結(jié)果，從中選取3段不同區(qū)域的氨基酸序列：65-79aa（Anti-DUF6-1）、233-247aa（Anti-DUF6-2）、425-439aa（Anti-DUF6-3）分別作為抗原進(jìn)行抗體制備。利用Tetras多通道多肽合成儀合成氨基酸序列，然后用高效液相色譜（HPLC）對3條短肽進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Anti-DUF6-1、Anti-DUF6-2、Anti-DUF6-3的蛋白純度分別為85.493%、88.281%、87.152%，3條短肽的蛋白質(zhì)純度都在85%以上，可以用來免疫新西蘭大白兔。

2.2 多克隆抗體制備及抗體效價檢測

用蛋白質(zhì)純度在85%以上的3條短肽分別免疫新西蘭雄性大白兔，獲得3份多克隆抗體血清。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對制備的多克隆抗體進(jìn)行血清效價檢測。結(jié)果表明，稀釋度為1：512000時，3份制備的抗體血清仍高于免疫前血清的2，1倍以上（表1）。

2.3 原核表達(dá)載體pGEX6p-1-DUF6的構(gòu)建、誘導(dǎo)和純化

以秈稻品種75-1-127的cDNA為模板，設(shè)計正反向引物OsDUF6-6P-1-F、OsDUF6-6P-1-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增OsDUF6編碼區(qū)的1449bp序列（圖3A），將目的片段導(dǎo)人原核表達(dá)載體pGEX6p-1中獲得重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta中。

挑取陽性克隆于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁菌體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測（圖3B）。結(jié)果表明，在加入IPTG的重組質(zhì)粒的宿主菌樣品中存在1條高豐度的蛋白質(zhì)條帶，相對分子質(zhì)量約80kD，與預(yù)期大小一致（原核表達(dá)載體pGEX6p-1中GST標(biāo)簽的大小約26kD，而OsDUF6相對分子質(zhì)量約57kD，兩者融合蛋白的總分子量大小與SDS-PAGE結(jié)果基本一致）。而誘導(dǎo)的蛋白主要在上清表達(dá)，說明OsDUF6蛋白具有較強(qiáng)的可溶性。

大量誘導(dǎo)重組蛋白，超聲破碎后收集上清。經(jīng)親和層析柱純化后得到的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有一條單一且大小與預(yù)期相符的條帶（圖3C），說明獲得純化的OsDUF6蛋白。

為了進(jìn)一步驗證所誘導(dǎo)重組蛋白的準(zhǔn)確性，用GST標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blotting檢測，發(fā)現(xiàn)GST抗體能特異性的識別pGEX6p-1-OsDUF6載體所表達(dá)的蛋白（圖4A），該結(jié)果表明成功誘導(dǎo)出GST-OsDUF6重組蛋白。

2.4 GST-OsDUF6重組蛋白驗證抗體特異性

為了初步驗證多克隆抗體是否制備成功，以GST-OsDUF6作為對照，驗證抗體結(jié)合GST-OsDUF6的特異性。取適量體積誘導(dǎo)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，一抗按照1-500稀釋比例進(jìn)行Westernblotting分析。結(jié)果顯示以上所制備的3個抗體均能與重組蛋白GST-OsDUF6結(jié)合（圖4-B、C、D），其中Anti-DUF6-1結(jié)合特異性最高，而Anti-DUf6-2及Anti-DUF6-3結(jié)合非特異蛋白能力較強(qiáng)。因此針對Anti-DUF6-1多克隆抗體進(jìn)行下一步驗證。

2.5 轉(zhuǎn)基因水稻植株驗證抗體特異性

為了進(jìn)一步驗證，提取陽性O(shè)sDUF6的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株以及非轉(zhuǎn)基因植株的總蛋白，并利用制備的抗體進(jìn)行Western blotting分析。結(jié)果顯示，在非轉(zhuǎn)基因植株和過表達(dá)植株中都能檢測到與OsDUF6蛋白大小一致的目的條帶，并且過表達(dá)植株中目的蛋白豐度明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株，符合轉(zhuǎn)基因水稻植株過表達(dá)特性（圖5），說明Anti-DUF6-1多克隆抗體能夠特異性識別水稻內(nèi)源的OsDUF6蛋白。根據(jù)上述結(jié)果綜合分析，通過人工合成短肽成功制備出水稻未知功能結(jié)構(gòu)域蛋白OsDUF6的特異性抗體，可正常運用于后續(xù)OsDUF6的蛋白功能研究。

3 討論與結(jié)論

DUFs家族基因具有的生物學(xué)功能是各不相同的。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物中有相當(dāng)數(shù)量并且特有的DUFs能夠參與植物中的一些生理生化反應(yīng)，如調(diào)控植物生長發(fā)育、非生物脅迫反應(yīng)以及病蟲害的防御反應(yīng)。

本研究通過對OsDUF6基因的生物信息學(xué)分析，從中選取了3段不同的氨基酸區(qū)域作為抗原進(jìn)行抗體制備，并利用Tetras多通道多肽合成儀進(jìn)行人工合成氨基酸序列。通過高效液相色譜法（HPLC）對3條短肽的蛋白純度進(jìn)行自檢并免疫新西蘭雄性大白兔，進(jìn)而得到效價為1：512000的3種抗體。目前抗體制備中普遍采用原核表達(dá)系統(tǒng)獲取目的蛋白的方法。雖然操作性強(qiáng)、成本低，但有一定的局限性，首先在進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)時，需對蛋白誘導(dǎo)的條件（如溫度、轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)劑濃度等）進(jìn)行探索，耗費大量的時間，不利于進(jìn)行下一步研究;其次，表達(dá)可溶性蛋白的效率較低，尤其對于分子量偏大的蛋白，如基因片段大于3kb的蜘蛛絲蛋白表達(dá)效率受限;此外，宿主菌（大腸桿菌）自身含有有毒蛋白，可能存在產(chǎn)物中影響重組蛋白的純度等。本研究利用儀器人工合成多肽進(jìn)行抗體制備，該方法方便快捷，合成的蛋白純度高、抗體的特異性好，時間短，并且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人工合成多肽的技術(shù)已經(jīng)日益成熟，因此該方法逐漸被科研工作者所推廣。

在驗證抗體特異性上，本研究利用原核誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)首先對制備的抗體進(jìn)行初步驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Anti-DUF6-1多克隆抗體能特異性結(jié)合重組蛋白GST-DUF6并且非特異結(jié)合少。但Anti-DUF6-1結(jié)合誘導(dǎo)重組蛋白不能直接說明抗體的實用性，需具有植物內(nèi)源蛋白特異性結(jié)合能力才能最終運用于后續(xù)研究中。以經(jīng)鑒定成功的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)水稻植株作為衡量抗體實用性的標(biāo)準(zhǔn)，在驗證結(jié)果中表明Anti-DUF6-1能特異性識別植物內(nèi)源OsDUF6蛋白，且過表達(dá)水稻植株OsDUF6蛋白含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株。由此推斷該制備的抗體可以用于水稻OsDUF6蛋白的功能分析。

總體來說，本研究成功制備出未知功能域蛋白OsDUF6的抗體，能特異性識別水稻內(nèi)源OsDUF6蛋白，對下一步用轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行功能分析具有重要意義。后續(xù)可對OsDUF6轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行表型鑒定，研究轉(zhuǎn)基因水稻在人工處理前后蛋白水平的變化，進(jìn)而研究OsDUF6在水稻中的生物學(xué)功能;OsDUF6抗體還能運用于研究該基因在水稻中的表達(dá)模式，分析該基因在水稻根、莖、葉及其他器官的表達(dá)水平。因此，OsDUF6多克隆抗體的制備，有利于進(jìn)一步研究OsDUF6在水稻中的生物學(xué)功能。