孔 藝，林莉莉，陳 永，賴 莎，吳紅衛(wèi)，陳吉生

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部 廣州 510080）

2019年12月，武漢市爆發(fā)了由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）。COVID-19具有傳播迅速廣泛、傳染性強、各類人群普遍易感的特點，輕癥患者出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、干咳等癥狀，嚴重者可出現(xiàn)呼吸困難、呼吸窘迫綜合征或膿毒癥休克等，臨床尚無針對性的特效藥物[1-3]。截至2020年3月19日，全球COVID-19病例已超過20萬，有8000多例死亡。我國首次報告無新增本土病例，這是一個驚人的成就[4]。

2020年2月20日，國家中醫(yī)藥管理局黨組書記、副局長余艷紅表示，堅持中醫(yī)藥治療COVID-19取得顯著成效。截至2020年3月22日，國家衛(wèi)生健康委先后發(fā)布了七版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，將血必凈注射液納入治療重型（氣營兩燔證）和危重型（內(nèi)閉外脫證）COVID-19方案中[5]。中央指導(dǎo)組專家組成員、東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院副院長邱海波表示，中藥血必凈注射劑對新冠肺炎患者效果良好。有相關(guān)研究表明，血必凈注射液能夠?qū)跔畈《緦?dǎo)致的炎癥因子風(fēng)暴或者炎癥反應(yīng)有抑制作用，對新型冠狀病毒也有一定的抑制作用[5]。

現(xiàn)代藥理學(xué)對血必凈注射液的研究局限于單一成分和單一靶標，而中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一新領(lǐng)域的研究旨在從系統(tǒng)層次和分子水平揭示中藥方劑的奧秘，促進中藥研究從當前的“單一靶標，單一藥物”模式轉(zhuǎn)向“網(wǎng)絡(luò)靶標，多成分藥物”的新模式。研究結(jié)果表明，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠為中醫(yī)學(xué)從基于經(jīng)驗的醫(yī)學(xué)邁向基于證據(jù)的醫(yī)學(xué)提供新的途徑，同時改進當前的藥物研究策略[7-9]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析血必凈注射液體內(nèi)有效成分的潛在作用靶點、作用通路及生物過程等信息，從分子層面闡釋其治療COVID-19的機制。

1 材料與方法

1.1 篩選活性成分和靶蛋白

本研究通過檢索國內(nèi)外文獻，篩選血必凈注射液在體內(nèi)外通過LC-MS方法均能定量檢測到的化學(xué)成分。經(jīng)Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）驗證和轉(zhuǎn)化，然后在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem、TargetNet[10]（http://targetnet.scbdd.com/）和Similarity Ensemble Approach數(shù) 據(jù) 庫（SEA,http://sea.bkslab.org/）獲取化合物對應(yīng)的靶點蛋白，同時使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt（http://www.uniprot.org/uploadlists/）轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一基因名稱。

1.2 新型冠狀病毒肺炎相關(guān)靶點搜集

Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）是一個可提供基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄、遺傳及功能上所有已知人類基因的平臺[11]。以“novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞，搜集COVID-19相關(guān)的靶點信息。將在Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索得到的冠狀病毒靶點與血必凈注射液的靶點在Venny 2.1.0中映射篩選出共同靶點，將其作為血必凈注射液的抗病毒靶點，導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1中構(gòu)建化合物-抗病毒靶點網(wǎng)絡(luò)，運用“Network Analyzer”功能分析其拓撲學(xué)屬性。

1.3 中藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將血必凈注射液活性成分及其相應(yīng)靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1中，構(gòu)建血必凈注射液中藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出其相關(guān)的拓撲數(shù)據(jù)如度值、介數(shù)等，并運用“Network Analyzer”功能分析其拓撲學(xué)屬性。度值和介數(shù)是評價一個節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中比重的重要拓撲學(xué)參數(shù)。度值可反映網(wǎng)絡(luò)中某節(jié)點與其他節(jié)點的鏈接數(shù)目，介數(shù)反映了網(wǎng)絡(luò)中所有最短的路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑的數(shù)目與最短路徑總數(shù)的比值。

1.4 構(gòu)建靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

為明確血必凈注射液潛在治療COVID-19靶點及靶點之間的相互作用，本研究將篩選出的靶點導(dǎo)入STRING網(wǎng)絡(luò)平臺（https://string-db.org/）中構(gòu)建靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction，PPI）。把蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，將評分條件（置信度）設(shè)定＞0.9，采用“Cytohubba”插件對“degree”進行分析，確定血必凈注射液治療COVID-19的核心靶點。

1.5 KEGG信號通路和GO生物過程富集分析

利用Cytoscape中的“ClueGO 2.5.5”插件對“1.2”和“1.3”中得到的血必凈注射液核心靶點，進行GO生物過程和KEGG信號通路富集分析。GO富集可了解靶點主要的作用過程，KEGG通路通過觀察靶點在通路中的分布情況，可進一步了解該靶點在代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中的作用。以P＜0.05進行靶基因篩選，得到血必凈注射液發(fā)揮作用的主要信號通路及參與的生物過程。

1.6 構(gòu)建血必凈注射液作用靶點通路圖

本研究采用KEGGMapper功能，將選擇的活性成分作用靶點在與免疫相關(guān)的作用通路上標注出來，驗證血必凈注射液通過多靶點、多途徑抗炎的作用機制。

2 結(jié)果

2.1 血必凈注射液候選化合物和對應(yīng)人類靶點篩選結(jié)果

通過檢索國內(nèi)外文獻[12-22]，篩選出血必凈注射液中和體內(nèi)均能定量檢測到的36個主要活性成分（表1）。其中，紅花有5個化學(xué)成分，赤芍10個化學(xué)成分，丹參13個化學(xué)成分，當歸1個化學(xué)成分，川芎和當歸共有2個化學(xué)成分，丹參和紅花共有3個化學(xué)成分，丹參和當歸共有2個化學(xué)成分。本研究采用TCMSP、PubChem、TargetNet和SEA數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點，并經(jīng)Uniprot校正后共獲得447個靶點。

2.2 構(gòu)建中藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

以“novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫中挖掘出與COVID-19相關(guān)靶點259個。將血必凈注射液的447個作用靶點與259個COVID-19相關(guān)靶點在Venny 2.1.0中映射得出70個共同靶點，將候選化合物與70個靶蛋白導(dǎo)入Cytoscape軟件，去除與靶點無交集的孤立成分，繪制網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），網(wǎng)絡(luò)中共有94個節(jié)點（其中24個化合物節(jié)點及70個靶蛋白節(jié)點）和222條邊。每個候選化合物平均作用于2.917（70／24）個靶點，而每個靶蛋白平均連接藥物的數(shù)量為3.171（222／70），說明了血必凈注射液是通過多成分-多靶點整體發(fā)揮作用。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，該網(wǎng)絡(luò)圖的網(wǎng)絡(luò)集中度為0.432、網(wǎng)絡(luò)密度為0.051、網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.320、最短路徑為8742。節(jié)點的度值（Degree）和介值中心度（Betweenness Centrality）是描述網(wǎng)絡(luò)節(jié)點重要性的常用指標[23]。在圖1中，節(jié)點的平均度值為4.7234，大于該平均度值的節(jié)點有30個；節(jié)點平均介值中心度為0.020463，大于該平均介值中心度的節(jié)點有22個。共有21個節(jié)點的度值和介值中心度均高于均值（見表2），其中化合物有10個，靶蛋白有11個?；衔锓謩e為槲皮素（A3）、沒食子酸（A11）、木犀草素（A32）、迷迭香酸（A28）、蘆?。ˋ33）、山萘酚（A2）、綠原酸（A34）、丹參酮IIa（A19）、羥基紅花黃色素A（A1）和芍藥苷（A5）。靶蛋白分別是

表1 血必凈注射液中有效化學(xué)組分

PTGS2、PTGS1、CASP3、RELA、TNF、HMOX1、MAPK1、IL6、NOS2、NOS3和PPARG。

圖1 中藥-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

表2 血必凈注射液成分-靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點及其拓撲學(xué)特征

2.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

為更好地探討血必凈注射液的作用機制，將血必凈注射液70個新型冠狀病毒肺炎相關(guān)靶點蛋白輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建靶蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)共有68個節(jié)點，222條相互作用關(guān)系，平均度值為6.53。將在STRING平臺中構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1中，利用Cytohubba插件中的Degree降序排列篩選出大于平均度值的核心靶點24個，圖3為排名前十的核心靶點。

2.4 GO生物過程分析

綜合2.2和2.3中所得到的32個（其中IL6、RELA和MAPK1重復(fù)）血必凈注射液關(guān)鍵靶點，進行GO生物過程富集分析，篩選出P＜0.05的生物過程91個。利用Cytoscape插件“ClueGo”得出GO生物過程富集分析的可視化結(jié)果，如圖4所示。涉及細胞因子活性、脂多糖細胞應(yīng)答、細胞因子生物合成過程調(diào)控和神經(jīng)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等生物過程，這些通路即是血必凈注射液重要靶標干預(yù)的生物學(xué)過程。

2.5 KEGG信號通路富集分析

對32個血必凈注射液關(guān)鍵靶點進行KEGG信號通路富集分析，篩選出P＜0.05的信號通路110條，利用Cytoscape插件“ClueGo”得出KEGG分析的可視化結(jié)果，如圖5所示，涉及IL-17信號通路、甲型流感、乙型和丙型病毒性肝炎及炎性腸病等通路。圖6為血必凈注射液活性成分對IL-17信號通路作用靶點標注圖。

3 討論

圖2 血必凈注射液相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 血必凈注射液核心靶點

血必凈由紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸組成，紅花中的黃酮類化合物、赤芍中的單萜苷類、川芎/當歸苯并呋喃酮類和丹參中的兒茶酚類化合物在XBJI中發(fā)揮重要作用，并于2004年批準為國家二類新藥，是我國唯一被批準治療膿毒癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征的中成藥[24-25]。一項發(fā)表于國際重癥醫(yī)學(xué)權(quán)威期刊Critical Care Medicine的研究表明，血必凈注射液具有降低重癥肺炎病死率的臨床價值[26]。但因成分復(fù)雜，其具體藥效成分、藥理作用尚無法準確闡明。

從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可知，血必凈注射液有效成分綜合評分最高的10個化合物分別屬于黃酮類、酚酸類、菲醌類、查爾酮苷類和單萜苷類，提示其是血必凈注射液發(fā)揮療效的重要活性成分。此外，血必凈注射液治療COVID-19可能與PTGS2、PTGS1、CASP3、RELA、TNF、MAPK1、IL2、IL6和IL10靶點有關(guān)，這些靶點都在炎癥的病理過程中起重要作用。COVID-19的嚴重程度與病毒和機體炎癥反應(yīng)的強度相關(guān)，如患者體內(nèi)出現(xiàn)過度的炎癥反應(yīng)，即“細胞因子風(fēng)暴（cytokine storm）”，將可能導(dǎo)致嚴重的后果甚至死亡。武漢金銀潭醫(yī)院一項發(fā)表于The Lancet的臨床研究[27]發(fā)現(xiàn)，重癥患者血漿中IL2，IL7，IL10，GSCF，IP10（CXCL10），MCP1(CCL2)，MIP1A(CCL3)和TNFα顯著高于非重癥患者。血必凈注射液主要通過抑制血清中IL6、TNFα、MCP1，MIP2和IL10減輕炎癥反應(yīng)。另一方面，有研究認為[29]，SARS-CoV-2與SARS-CoV兩種病毒感染的途徑均通過其表達的S-蛋白與人體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE2）結(jié)合，導(dǎo)致病毒侵入機體而致病。冠狀病毒的3CL水解酶（也稱Main proteinase，Mpro）通過對pp1a（相對分子質(zhì)量486 000）和pp1ab（相對分子質(zhì)量790 000）2種多聚蛋白復(fù)制酶泛水解，在介導(dǎo)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是治療SARS和其他冠狀病毒的理想靶點[30-31]。更重要的是，槲皮素、木犀草素和山柰酚與ACE2和SARS-CoV-2 3CL水解酶均具有良好的結(jié)合能力[32-34]。以上結(jié)果說明，血必凈注射液不僅可通過調(diào)控炎癥通路，還可能通過抑制病毒入侵和復(fù)制，發(fā)揮治療COVID-19的作用，體現(xiàn)了血必凈注射液多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。

圖4 GO生物過程分析

圖5 KEGG信號通路富集分析

圖6 血必凈注射液活性成分在免疫相關(guān)通路中的作用靶點標注圖

進一步分析血必凈注射液GO生物過程和KEGG信號通路富集結(jié)果，本研究通過GO生物過程富集分析發(fā)現(xiàn)血必凈注射液靶點主要涉及細胞因子活性、脂多糖細胞應(yīng)答、細胞因子生物合成過程調(diào)控和神經(jīng)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等生物過程。KEGG信號通路富集在IL17信號通路、甲型流感病毒、乙型和丙型病毒性肝炎及炎性腸病等通路。SARS-CoV-2感染導(dǎo)致強烈的免疫反應(yīng)和炎癥風(fēng)暴，此過程中大量細胞因子被激活，與SARS-CoV相似。特別地，Th17細胞的主要功能是促進中性粒細胞的動員、募集和活化，介導(dǎo)促炎癥反應(yīng)，一系列細胞因子如TGFB、IL6、IL9、IL1、IL23、IL21、IRF4、STAT3參與了Th17細胞分化過程。血必凈注射液的多通路可能通過調(diào)控免疫和炎癥相關(guān)的信號通路，起到抑制活化的細胞因子、緩和過激的免疫反應(yīng)、消除炎癥的作用。

綜上所述，血必凈注射液的調(diào)控過程除了針對SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)上的3CL水解酶，更注重在病毒入侵后對宿主自身免疫抗感染能力的調(diào)控和干預(yù)。因此，血必凈注射液通過多成分、多靶點和多通路的共同作用治療COVID-19。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，后期還將對通路進行驗證，為血必凈注射液治療COVID-19提供實驗依據(jù)。