于淼，陳冰嬬，石貴山，李海清，葛占宇，楊永志，徐寧，檀輝，李翠麗，王鼐

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所，吉林公主嶺136100；2.赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古赤峰024031）

土壤鹽堿化是影響植物生長并限制作物產(chǎn)量的嚴(yán)重農(nóng)業(yè)問題之一［1，2］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球鹽堿土面積大約有9.8×108hm2，約占全球土地面積的10%，中國鹽堿土總面積大約有1.0×108hm2，占耕地總面積的 4.9%，且有逐年增加的趨勢［3，4］。其中東北地區(qū)是土壤鹽堿化最嚴(yán)重的地區(qū)之一，主要成分是以Na2CO3和NaHCO3為主的蘇打鹽堿土［5］。其具有與中性鹽脅迫相同的Na+離子毒害作用，大量的CO32+、HCO3

-使土壤 pH 升高，嚴(yán)重影響了作物體內(nèi)核酸復(fù)制、蛋白質(zhì)合成等代謝過程，抑制種子萌發(fā)進(jìn)程［6］，堿脅迫對(duì)作物的危害高于鹽脅迫［7］。培育和推廣耐鹽堿作物是提高鹽堿地宜耕土地面積最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。

高粱（Sorghnm bicolor（L.）Moench）具有耐旱、耐鹽堿等多重抗逆性，且光合效率高，廣泛種植在我國的旱地、洼地、鹽堿地等邊際性土地上［8，9］。目前種植的高粱品種以釀酒專用型的粒用雜交種為主［10］。因此，建立不同粒用高粱親本系耐堿鑒定方法和評(píng)價(jià)體系對(duì)高粱耐堿種質(zhì)創(chuàng)新和雜交種選育以及堿土有效利用具有重要意義。然而對(duì)于混合堿脅迫研究，多集中在甜高粱［11］和雜交種［12］的鑒定篩選，可用的耐堿種質(zhì)資源和基因未見報(bào)道，制約著高粱耐堿育種的發(fā)展。李豐先等［12］以 25 mmol·L-1混 合 堿（NaHCO3∶Na2CO3的摩爾比為9∶1）溶液為脅迫液，綜合評(píng)定了35 個(gè)高粱雜交種的耐堿性。尚培培等［13］以耐堿性差異較大的2 個(gè)雜交種為材料，研究了混合堿脅迫對(duì)高粱幼苗生理生化的影響。任增根等［14］用混合堿（NaHCO3∶Na2CO3摩爾比 1∶1）篩選鑒定了 8 個(gè)高粱品種的耐堿性。

本研究分析146 份粒用高粱親本系堿脅迫下萌發(fā)期的各個(gè)性狀，采用隸屬函數(shù)值法轉(zhuǎn)換的S 值對(duì)耐堿性進(jìn)行分級(jí)，建立了一種準(zhǔn)確高效的粒用高粱耐堿鑒定評(píng)價(jià)方法，為粒用高粱親本系萌發(fā)期耐堿性鑒定提供理論依據(jù)以及高粱耐堿種質(zhì)創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為146 份粒用高粱親本系，包括53份保持系（B-line）、93 份恢復(fù)系（R-line），分別來自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、錦州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、赤峰市農(nóng)牧科學(xué)院、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、美國得克薩斯農(nóng)業(yè)與機(jī)械大學(xué)、澳大利亞昆士蘭大學(xué)。由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源所保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 堿脅迫適宜濃度的確定

挑 選 吉 2055B、 314B、 SX44B、 522B、TAM428B、15H379、GLS、G002、LT、2115 共 10份材料，設(shè)置 NaHCO3∶Na2CO3=9∶1 摩爾質(zhì)量濃度分別為 0（CK）、25、50、75、100、150 和 200 mmol·L-1（實(shí)際測得的pH 和電導(dǎo)率見表1）溶液進(jìn)行脅迫，共6 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每次重復(fù) 25粒種子。將種子用自來水清洗2 次，75%的酒精消毒1 min，經(jīng)0.1%的氯化汞溶液消毒10 min，自來水沖洗3 次，去離子水沖洗3 次，吸干種子表面水分，放入鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中。加入堿脅迫液8 mL，溫度25℃，濕度60%的培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)10 d。每2 d 補(bǔ)充適量蒸餾水，以保持脅迫液的濃度不變。第4 天調(diào)查每個(gè)培養(yǎng)皿的種子發(fā)芽數(shù)（發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)為胚根長度≥1/2 種子長度），計(jì)算種子的發(fā)芽勢。第10 天調(diào)查每個(gè)培養(yǎng)皿的種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算種子發(fā)芽率，每個(gè)培養(yǎng)皿挑選生長時(shí)期基本一致的10 株幼苗，測量芽長、根長。

1.2.2 146 份粒用高粱親本系對(duì)堿脅迫的響應(yīng)

選取 50 mmol·L-1濃度的堿脅迫液處理 146 份粒用高粱親本系，種子處理與培養(yǎng)方法與堿脅迫適宜濃度的確定一致。分別于第 2、4、6、8、10 天調(diào)查每個(gè)培養(yǎng)皿的種子發(fā)芽數(shù)。在第10 天，將放在培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)皿取出，每個(gè)培養(yǎng)皿挑選基本一致的10 個(gè)幼苗，測定芽長、根長、中胚軸長、芽鮮重、根鮮重，于85 ℃烘干后稱量芽干重、根干重。

發(fā)芽勢=第4 天發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%；

發(fā)芽率=第10 天發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑(Gt/Dt)（其中，Gt 為第 t日的發(fā)芽種子個(gè)數(shù)，Dt 為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)）；

活力指數(shù)（VI）=胚根鮮重×發(fā)芽指數(shù)；

相對(duì)值=脅迫值/對(duì)照值×100%。

表1 不同堿脅迫溶液的pH 和電導(dǎo)率Table 1 Conductivity and pH of different saline-alkali stress solutions

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS19.0 軟件對(duì)測定指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、主成分分析和相關(guān)性分析。在EXCEL 2010 中采用公式（1）計(jì)算隸屬函數(shù)值，采用公式（2）計(jì)算耐堿評(píng)價(jià)S 值。

公式（1）中計(jì)算各性狀的隸屬函數(shù)值，Xj表示第j 個(gè)性狀的相對(duì)值；Xmin、Xmax分別表示第 j 個(gè)性狀相對(duì)值的最小值和最大值。公式（2）計(jì)算各性狀的平均隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒用高粱萌發(fā)期耐堿鑒定適宜濃度的確定

不同濃度蘇打堿脅迫下，10 份高粱種質(zhì)的發(fā)芽勢等5 個(gè)萌發(fā)性狀的統(tǒng)計(jì)分析表明（表2），在濃度為25 mmol·L-1脅迫處理下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、芽長、根長與對(duì)照相比差異不顯著，但是2055B、15H379、2115 的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長和根長均高于對(duì)照。在50 mmol·L-1脅迫處理下，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、芽長、根長與對(duì)照相比在0.01 水平下極顯著降低，尤其根長與對(duì)照相比明顯下降，下降了65.75 %，然而522B、SX44B 與對(duì)照相比，發(fā)芽勢和發(fā)芽率變化不明顯。在75 mmol·L-1脅迫處理下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽勢的均值降為對(duì)照的一半，高粱的根長表現(xiàn)無或極短。脅迫濃度升高到150 mmol·L-1，所有材料的萌發(fā)均受到明顯抑制，各萌發(fā)指標(biāo)值均顯著下降。200 mmol·L-1脅迫下，少數(shù)材料能夠萌發(fā)，但萌發(fā)后期多為畸形、壞死、不能正常生長。因此，本試驗(yàn)選用50 mmol·L-1（NaHCO3∶Na2CO3=9∶1）為粒用高粱萌發(fā)期耐堿鑒定的適宜濃度。

表2 不同濃度堿脅迫下10 份高粱種質(zhì)性狀的統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistic analysis of 10 sorghum germplasm traits at different alkali concentrations

2.2 堿脅迫對(duì)萌發(fā)期粒用高粱親本系的影響

對(duì)146 份粒用高粱親本系萌發(fā)期性狀相對(duì)值的描述統(tǒng)計(jì)表明，在 50 mmol·L-1的堿脅迫下，除部分親本系的發(fā)芽勢和發(fā)芽率外，萌發(fā)期各性狀相對(duì)值均小于100%，表明各性狀均受到不同程度地抑制，不同性狀相對(duì)值的均值和變異系數(shù)也不相同（表 3）。 其中，相對(duì)根長均值最低，為12.36%；相對(duì)中胚軸長度次之，為15.51%，相對(duì)發(fā)芽勢均值最大，為68.25%；說明在堿脅迫下高粱的根長和中胚軸的長度抑制程度較大，發(fā)芽勢的抑制程度較小。各性狀相對(duì)值變異系數(shù)最大的是根長，為82.18%，說明堿脅迫下粒用高粱親本系的根長差異最明顯，變異系數(shù)最小的是發(fā)芽勢，為29.72%。

2.3 粒用高粱親本系萌發(fā)期耐堿分級(jí)評(píng)價(jià)方法

通過計(jì)算11 個(gè)相對(duì)性狀的平均隸屬函數(shù)值，獲得耐堿評(píng)價(jià)S 值。根據(jù)S 值對(duì)146 份參試材料劃分耐堿分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。S 值在0.80～1.00 為1級(jí)強(qiáng)耐堿（HT），0.60～0.80 為 2 級(jí)耐堿（T），0.40～0.60 為 3 級(jí)中等耐堿（MT），0.20～0.40 為4 級(jí) 堿 敏 感（S），0.00～0.20 為 5 級(jí) 堿 極 敏 感（HS）。

表3 堿脅迫下粒用高粱親本系萌發(fā)期性狀相對(duì)值的描述統(tǒng)計(jì)Table 3 Descriptive statistics on relative traits of sorghum parental lines at germination stage under alkali stress 單位：%

2.4 146 份粒用高粱親本系萌發(fā)期耐堿性評(píng)價(jià)

根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)146 份粒用高粱親本系的S值進(jìn)行耐堿級(jí)別的劃分（表4）。耐堿1 級(jí)的包括吉4327R 1 份材料，屬于恢復(fù)系，占參試材料的0.68%，耐堿評(píng)價(jià)為HT。耐堿2 級(jí)的包括MH、G17-123B、5222B、SX44B、TAM428B、06H419、吉R117、15H369，共8 份材料，其中保持系材料4份，恢復(fù)系材料4 份，占參試材料的5.47%，耐堿評(píng)價(jià) 為 T。 耐 堿 3 級(jí) 的 包 括 LT、7788、10125R、QL34B、吉 R107 等，共 62 份材料，其中保持系材料29 份，恢復(fù)系材料33 份，占參試材料的42.46%，耐堿評(píng)價(jià)為MT。耐堿4 級(jí)的包括2483、哲3B、2013B1、y288-2、115B 等，共 56 份材料，其中保持系材料14 份，恢復(fù)系材料42 份，占參試材料的38.35%，耐堿評(píng)價(jià)為S。耐堿5 級(jí)的包括龍188B、2124、外 4、哲 23B、5933、QL33B，共 19 份材料，其中保持系材料6 份，恢復(fù)系材料13 份，占參試材料的13.01%，耐堿評(píng)價(jià)為HS。

表4 146 份粒用高粱親本系耐堿性評(píng)價(jià)Table 4 Evaluation of alkali tolerance of 146 sorghum parental lines

2.5 堿脅迫下粒用高粱萌發(fā)期各性狀的相關(guān)性分析

對(duì)堿脅迫下粒用高粱親本系萌發(fā)期11 個(gè)性狀的相對(duì)值進(jìn)行相關(guān)性分析（表5），相對(duì)根長、相對(duì)根鮮重和相對(duì)根干重與相對(duì)發(fā)芽勢、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)中胚軸長度之間相關(guān)不顯著，與其余7 個(gè)指標(biāo)之間呈顯著或極顯著正相關(guān)。其中，相對(duì)發(fā)芽指數(shù)與相對(duì)發(fā)芽勢呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)最高，達(dá)到了0.942，相對(duì)活力指數(shù)與相對(duì)根鮮重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.872。相對(duì)中胚軸長與相對(duì)芽長呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.774。S 值與萌發(fā)期各性狀相對(duì)值之間均呈顯著正相關(guān)，與相對(duì)芽鮮重相關(guān)系數(shù)最高，為0.891，與相對(duì)根干重相關(guān)系數(shù)最低，為0.326。

表5 堿脅迫下粒用高粱萌發(fā)期各性狀的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of different traits of sorghum germination under alkali stress

2.6 粒用高粱萌發(fā)期耐堿性狀的主成分分析

對(duì)堿脅迫下粒用高粱親本系萌發(fā)期11 個(gè)性狀的相對(duì)值進(jìn)行主成分分析（表6）。第Ⅰ主成分貢獻(xiàn)率為50.49%，第Ⅱ主成分貢獻(xiàn)率為20.80%，第Ⅲ主成分的貢獻(xiàn)率為10.57%，前3 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)81.877%，考慮累計(jì)貢獻(xiàn)率大于80%和特征值大于1 的原則，說明前3 個(gè)主成分能夠代表11 個(gè)性狀的基本信息，符合主成分分析的要求。

從各個(gè)指標(biāo)的載荷矩陣分析（表7），相對(duì)芽長、相對(duì)芽鮮重和相對(duì)芽干重，相對(duì)發(fā)芽勢、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)在第I 主成分中的載荷比較大，說明第Ⅰ主成分主要反映的是胚芽萌發(fā)生長的重要指標(biāo)，其中相對(duì)芽鮮重的載荷量最大，為0.90。在第II 主成分中相對(duì)活力指數(shù)，相對(duì)根長與相對(duì)根鮮重、相對(duì)根干重的載荷較大，反映的是根部性狀的重要指標(biāo)，其中相對(duì)根鮮重載荷量最大為0.8。第III 主成分中相對(duì)中胚軸長、相對(duì)芽長、相對(duì)根長的載荷量較大，反映的是種子伸長的狀況，其中相對(duì)中胚軸長載荷量最大為0.54。

表6 3 個(gè)主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Table 6 Eigenvalue and contribution rates of three principal components

2.7 粒用高粱萌發(fā)期耐堿性鑒定指標(biāo)的篩選

計(jì)算相對(duì)根鮮重、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)中胚軸長性狀的平均隸屬函數(shù)值S1，以S1值為橫軸，S 值為縱軸，繪制兩者間的線性關(guān)系圖（圖1），兩者也呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.9421。根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)146 份粒用高粱親本系的S1值進(jìn)行耐堿評(píng)價(jià)，編號(hào)98 的吉4327R 的平均隸屬函數(shù)值最高，為 0.8408，編號(hào) 124 最低，為 0.013，與 11 個(gè)指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值排序一致。只有21 份種質(zhì)在耐堿分級(jí)稍有不同，其余125 份材料耐堿分級(jí)一致。由此可知，利用相對(duì)中胚軸長、相對(duì)芽鮮重、相對(duì)根鮮重這3 個(gè)性狀對(duì)146 份粒用高粱親本系的評(píng)價(jià)結(jié)果與11 個(gè)性狀的評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，可以作為粒用高粱萌發(fā)期耐堿性篩選的鑒定指標(biāo)。

表7 各因子載荷矩陣Table 7 Factor loading matrix of each component

圖1 S1值與S 值評(píng)價(jià)高粱耐堿性的關(guān)系Fig.1 Evaluation of sorghum alkali tolerance based on S1 value and S value

3 討論與結(jié)論

我國現(xiàn)有鹽堿地類型復(fù)雜，土壤中鹽分組成多樣［15］。吉林省中西部鹽堿化地區(qū)的土壤主要含有 Na+、CO32-、HCO3-，pH 在 9.0 以上［16］。而且，以Na2CO3和NaHCO3為主要成分的堿脅迫對(duì)植物生長發(fā)育的危害遠(yuǎn)大于NaCl 與Na2SO4為主的鹽脅迫［17，18］，本試驗(yàn)將 2 種堿性鹽 NaHCO3和 Na2CO3按摩爾比 9∶1 配置，混合液的 pH 在 9.25 左右，以此模擬吉林省中西部土壤環(huán)境更加具實(shí)踐意義。

作物萌發(fā)期耐鹽性研究發(fā)現(xiàn)，不同作物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)不同，耐鹽鑒定的適宜濃度也不相同［19～21］。相同作物不同基因型種質(zhì)對(duì)鹽響應(yīng)的濃度也不相同［22，23］。本研究測量了 10 份材料在不同堿脅迫濃度下的5 個(gè)萌發(fā)性狀，發(fā)現(xiàn)隨著堿濃度的增加高粱的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、芽長、根長均呈下降趨勢。在25 mmol·L-1脅迫下，個(gè)別材料的萌發(fā)能力強(qiáng)于對(duì)照，說明該濃度對(duì)高粱親本系的萌發(fā)有促進(jìn)作用，但是當(dāng)濃度增加到50 mmol·L-1時(shí)，各性狀較對(duì)照均顯著降低。這說明高粱在適宜堿脅迫濃度下萌發(fā)能力會(huì)增強(qiáng)，超過一定濃度后才會(huì)產(chǎn)生抑制作用，這與小麥［24］、芝麻［25］、棉花［26］等作物耐鹽性的研究結(jié)果類似。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果高粱各性狀在 25 mmol·L-1和 50 mmol·L-1脅迫下差異顯著，都可以作為篩選濃度，但是考慮到低濃度堿性鹽的鹽堿地在實(shí)際中很難遇到，因此選擇50 mmol·L-1脅迫濃度鑒定高粱親本系。這也是與李豐先等［12］篩選高粱雜交種的濃度不一樣的原因之一，其次是培養(yǎng)環(huán)境不同，該研究培養(yǎng)環(huán)境是12 h 光照和12 h 黑暗，本研究種子萌發(fā)培養(yǎng)環(huán)境為24 h 黑暗處理，具體的遺傳效應(yīng)和生理機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

鹽堿脅迫后植物的多種萌發(fā)性狀變化直接反映了鹽害程度［27］。單一的性狀評(píng)價(jià)作物耐鹽堿特性具有一定的局限性，且作物耐鹽堿性是基因和環(huán)境互作的多種萌發(fā)性狀的綜合表現(xiàn)［28］。因此選取有代表性的指標(biāo)，建立客觀的評(píng)價(jià)體系，對(duì)高粱品種萌發(fā)期耐堿的評(píng)價(jià)和大批量篩選耐堿種質(zhì)和雜交種至關(guān)重要。前人以平均隸屬函數(shù)值法對(duì)性狀的相對(duì)值進(jìn)行耐堿排序，再通過聚類分析進(jìn)行耐堿分級(jí)［29，30］。但聚類分析在樣本量較大時(shí)，獲得聚類結(jié)論有一定困難，本研究根據(jù)平均隸屬函數(shù)值的大小范圍進(jìn)行耐堿級(jí)別劃分，把146 份粒用高粱親本系劃分為強(qiáng)耐堿、耐堿、中等耐堿、堿敏感、堿極敏感，共5 個(gè)耐堿級(jí)別。同時(shí)，本研究選取了相對(duì)發(fā)芽勢等11 個(gè)性狀對(duì)高粱的萌發(fā)期耐堿進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，相關(guān)分析表明，這些鑒定指標(biāo)之間存在顯著和極顯著的相關(guān)性，我們采用因子分析，通過對(duì)多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行降維處理，篩選到3 個(gè)主成分可代表不同處理間變異的全部信息，其中相對(duì)中胚軸長、相對(duì)葉鮮重、相對(duì)根鮮重分別在3 個(gè)主成分中載荷最大。為了進(jìn)一步證明3 個(gè)指標(biāo)可以作為耐堿性的鑒定指標(biāo)，我們計(jì)算了這3 個(gè)性狀的平均隸屬函數(shù)值S1，與S 值進(jìn)行比較分析，確定了相對(duì)中胚軸長、相對(duì)芽鮮重、相對(duì)根鮮重這3 個(gè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)粒用高粱萌發(fā)期耐堿性的主要鑒定指標(biāo)。