陳章健，韓 碩，鄭 湃，周淑佩，賈 光△

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191； 2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，北京 100191)

二氧化鈦(TiO2)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用主要是作為食品添加劑[1]。美國(guó)食品與藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)在2002年認(rèn)可二氧化鈦為安全物質(zhì)，對(duì)人體并無傷害[2]，我國(guó)也已正式公布二氧化鈦可用于食品著色劑(GB25577-2010)， 并詳細(xì)規(guī)定了二氧化鈦的適用范圍和最大使用量。但隨著納米技術(shù)在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)領(lǐng)域的不斷開發(fā)與應(yīng)用，納米材料在食品中的應(yīng)用也越來越廣泛[3]。近期的研究表明，納米二氧化鈦在食品和其他消費(fèi)品中的含量不斷增加，食品級(jí)二氧化鈦中納米顆粒的數(shù)量已達(dá)到36%左右[4-5]。同時(shí)，調(diào)查顯示，納米二氧化鈦在口香糖、飲料和糖果等含糖量較高的食物中含量最高,兒童由于喜歡食用這些甜食而成為納米二氧化鈦的潛在高暴露人群，其攝入量約為成年人的2～3倍[5]。納米二氧化鈦常會(huì)與較高劑量的糖共同經(jīng)口被兒童長(zhǎng)期攝入，因此，研究納米二氧化鈦與糖類長(zhǎng)期聯(lián)合經(jīng)口暴露對(duì)兒童的健康影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

納米材料的特殊理化性質(zhì)使其在生物體內(nèi)表現(xiàn)出特殊的生物學(xué)作用，納米二氧化鈦在食品中的安全性研究受到關(guān)注。已有研究表明，肝臟可能是納米二氧化鈦的經(jīng)口毒性靶器官，因此，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝可能會(huì)產(chǎn)生影響[6]。納米二氧化鈦經(jīng)口攝入還可以加重胃腸道炎癥，從而影響其吸收功能[7]。葉酸和維生素B12是維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能健全不可缺少的維生素，同時(shí)在促進(jìn)紅細(xì)胞發(fā)育和成熟以及預(yù)防惡性貧血方面也發(fā)揮重要作用。它們的吸收和代謝如果受到影響將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的健康損害。近年來，納米二氧化鈦經(jīng)口攝入導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)損害的相關(guān)文章不斷出現(xiàn)[8]，生殖發(fā)育毒性造成的子代神經(jīng)系統(tǒng)損傷也屢見報(bào)道[9]。因此，納米二氧化鈦很可能通過影響機(jī)體葉酸和維生素B12的代謝從而導(dǎo)致一系列的健康損傷。

本研究將探討納米二氧化鈦與葡萄糖亞慢性(90 d)聯(lián)合經(jīng)口暴露對(duì)幼年大鼠血清葉酸和維生素B12的影響，并對(duì)兩者可能存在的交互作用進(jìn)行分析，希望為納米二氧化鈦經(jīng)口毒性機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 納米材料與表征

納米二氧化鈦購(gòu)買于上海晶純實(shí)業(yè)有限公司(阿拉丁試劑)。納米二氧化鈦的純度使用電感耦 合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS；IRIS Advantag，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，晶型使用X射線衍射儀(X-ray diffractometer，XRD；PANalytical’s X’Pert PRO，荷蘭)進(jìn)行分析，同時(shí)采用掃描電鏡(NanoSEM430，美國(guó)FEI Company)檢測(cè)納米二氧化鈦顆粒的形態(tài)和原始粒徑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌雄各40只清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠(3周齡，雌性體質(zhì)量64～98 g，雄性體質(zhì)量85～109 g)，購(gòu)買并飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0010，SYXK(京)2016-0041]。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為8組，采用2×4析因設(shè)計(jì)，對(duì)照組(蒸餾水)、低劑量(2 mg/kg)納米二氧化鈦組、中劑量(10 mg/kg)納米二氧化鈦組、高劑量(50 mg/kg)納米二氧化鈦組和葡萄糖(1.8 g/kg)染毒組、低劑量納米二氧化鈦+葡萄糖染毒組、中劑量納米二氧化鈦+葡萄糖染毒組、高劑量納米二氧化鈦+葡萄糖染毒組，每組10只，雌雄各半。納米二氧化鈦的染毒劑量選擇基于美國(guó)10歲以下兒童納米二氧化鈦的經(jīng)口攝入估計(jì)量(0.5 mg/kg體質(zhì)量)[5]，并使用100作為安全系數(shù)，計(jì)算得50 mg/kg作為大鼠灌胃染毒的最高劑量。葡萄糖的染毒劑量(1.8 g/kg)選擇基于美國(guó)兒童和青少年附加糖(added sugar)的攝入量(360 kcal/d)[10]。葡萄糖的能量系數(shù)為4 kcal/g，青少年平均體質(zhì)量以50 kg計(jì)算，因此，360 kcal/d相當(dāng)于每天攝入葡萄糖1.8 g/kg。

1.3 大鼠灌胃染毒

將納米二氧化鈦或納米二氧化鈦加葡萄糖懸浮于蒸餾水中，使用前超聲波分散10 min，并渦旋混勻。灌胃體積為1 mL/只，每天上午染毒1次，持續(xù)90 d，每日更換新鮮配制的納米二氧化鈦染毒液。每天觀察記錄動(dòng)物的一般情況，每周稱重。染毒期間，未觀察到動(dòng)物異常表現(xiàn)，各組動(dòng)物體質(zhì)量無明顯差異。處死前禁食12 h，不禁水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循了北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)和國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，倫理批準(zhǔn)號(hào)LA2017073。

1.4 血清葉酸和維生素B12檢測(cè)

染毒90 d后處死動(dòng)物，取腹主動(dòng)脈血1 mL促凝，1 500×g離心10 min，取上清液。采用放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)檢測(cè)血清中葉酸和維生素B12濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)表征

本實(shí)驗(yàn)所用納米二氧化鈦的物理化學(xué)性質(zhì)在我們前期的文章中已有詳細(xì)表征[11]。如表1所示，納米二氧化鈦的純度為99.9%，晶體結(jié)構(gòu)為銳鈦礦，近球形顆粒，平均粒徑為(24±5) nm。納米二氧化鈦(1 mg/mL)在水溶液中的水合粒徑為40.8 nm，而在葡萄糖(0.2 g/mL)溶液中的水合粒徑為74.5 nm，說明葡萄糖可以增加納米二氧化鈦在溶液中的團(tuán)聚程度。同時(shí)，納米二氧化鈦(1 mg/mL)在水溶液中的Zeta電位為11.09 mV，而在葡萄糖(0.2 g/mL)溶液中的Zeta電位為4.62 mV，說明納米二氧化鈦在葡萄糖溶液中的穩(wěn)定性出現(xiàn)下降，因此，團(tuán)聚程度增加。

2.2 大鼠一般情況和體質(zhì)量

如圖1所示，納米二氧化鈦和葡萄糖聯(lián)合經(jīng)口暴露90 d內(nèi)，大鼠從4周齡到16周齡左右，經(jīng)歷幼年期到成年期的生長(zhǎng)發(fā)育階段，體質(zhì)量隨時(shí)間不斷增加，但相同染毒時(shí)間不同染毒組雌性和雄性SD大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在本實(shí)驗(yàn)所用劑量下，納米二氧化鈦和葡萄糖經(jīng)口暴露對(duì)大鼠體質(zhì)量無明顯影響。同時(shí)，未觀察到染毒期間SD大鼠一般情況出現(xiàn)異常，未見大鼠死亡。

2.3 血清葉酸

納米二氧化鈦和葡萄糖聯(lián)合經(jīng)口暴露90 d可導(dǎo)致SD大鼠血清葉酸濃度改變。如圖2所示，與對(duì)照組相比，雌性大鼠葡萄糖染毒組血清葉酸濃度明顯上升[(68.4±8.7) μg/Lvs. (55.8±4.8)μg/L]，雄性大鼠中劑量納米二氧化鈦+葡萄糖染毒組血清葉酸濃度明顯上升[(81.4±20.8) μg/Lvs. (63.2±4.4) μg/L]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與單純葡萄糖染毒組相比，雌性大鼠低劑量和高劑量納米二氧化鈦+葡萄糖染毒組血清葉酸濃度均明顯下降[(53.6±4.6)μg/L、(60.6±4.2)μg/Lvs. (68.4±8.7)μg/L]，雄性大鼠中劑量納米二氧化鈦+葡萄糖染毒組血清葉酸濃度明顯上升[(81.4±20.8) μg/Lvs. (8.0±5.3)μg/L]，高劑量納米二氧化鈦+葡萄糖染毒組血清葉酸濃度明顯下降[(55.2±7.3)μg/Lvs. (68.0±5.3)μg/L]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雌性和雄性大鼠在暴露較高劑量葡萄糖后，納米二氧化鈦對(duì)其血清葉酸濃度的改變均具有差別，說明納米二氧化鈦和葡萄糖聯(lián)合暴露時(shí)可能存在交互作用。

2.4 血清維生素B12

納米二氧化鈦和葡萄糖聯(lián)合經(jīng)口暴露90 d可導(dǎo)致SD大鼠血清維生素B12濃度改變。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組雌性大鼠和雄性大鼠中血清維生素B12濃度未見明顯變化，但與單純葡萄糖染毒組相比，雄性大鼠低劑量納米二氧化鈦+葡萄糖染毒組血清維生素B12濃度明顯上升[(662.0±61.8) ng/Lvs. (496.0±86.8) ng/L]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。雄性大鼠暴露于較高劑量葡萄糖后，納米二氧化鈦對(duì)血清維生素B12濃度的改變具有輕微差別，這可能也與納米二氧化鈦和葡萄糖的交互作用有關(guān)。

2.5 納米二氧化鈦和葡萄糖的聯(lián)合作用

經(jīng)聯(lián)合作用分析，納米二氧化鈦與葡萄糖聯(lián)合暴露對(duì)SD大鼠血清葉酸濃度的影響存在交互作用。三維模擬結(jié)果顯示，在雌性大鼠中，單純納米二氧化鈦染毒時(shí)，血清葉酸濃度隨劑量增加變化較??；單純葡萄糖染毒時(shí)，血清葉酸濃度隨劑量增加逐漸上升；當(dāng)納米二氧化鈦與葡萄糖聯(lián)合暴露時(shí)，血清葉酸濃度反而隨著兩者劑量增加出現(xiàn)下降，說明納米二氧化鈦與葡萄糖聯(lián)合暴露對(duì)SD大鼠血清葉酸濃度的影響存在明顯的拮抗作用(P<0.05，圖4)。

3 討論

本研究關(guān)注納米二氧化鈦和葡萄糖對(duì)大鼠血清葉酸和維生素B12的影響，葉酸和維生素B12都在維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能方面發(fā)揮重要作用。近年來，納米二氧化鈦對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用受到廣泛關(guān)注，研究表明納米二氧化鈦可穿過血腦屏障，積聚在大腦，尤其是皮質(zhì)和海馬[12]。無論是在體外還是在體內(nèi)，納米二氧化鈦的暴露都會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、活性氧的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活細(xì)胞死亡信號(hào)通路，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還觀察到空間識(shí)別記憶和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)障礙[12]。目前，相關(guān)機(jī)制主要集中在納米二氧化鈦可以誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥，進(jìn)而產(chǎn)生腦損傷[12]。本研究從維持神經(jīng)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葉酸和維生素B12的角度，探討納米二氧化鈦導(dǎo)致神經(jīng)毒性的可能機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn),納米二氧化鈦單獨(dú)經(jīng)口暴露并未對(duì)大鼠血清葉酸和維生素B12的濃度產(chǎn)生影響，但納米二氧化鈦與葡萄糖聯(lián)合暴露時(shí)會(huì)導(dǎo)致大鼠血清葉酸濃度明顯升高，這可能主要是高糖攝入的影響，葉酸代謝與能量代謝的關(guān)系是非常緊密的[13]。但與納米二氧化鈦同時(shí)暴露卻可以降低葡萄糖的效應(yīng)，在一般大鼠和攝入較高劑量葡萄糖大鼠中，納米二氧化鈦對(duì)血清葉酸濃度的影響不同，前者未見明顯影響，后者可以導(dǎo)致血清葉酸濃度降低，說明納米二氧化鈦與葡萄糖在影響大鼠血清葉酸濃度方面存在明顯的拮抗作用。這可能與葡萄糖可以增加納米二氧化鈦在溶液體系中的團(tuán)聚程度有關(guān)(表1)， 納米二氧化鈦團(tuán)聚程度越嚴(yán)重，水合粒徑越大，相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)也會(huì)減弱，這在前期研究中已有所體現(xiàn)[14]，但是否為主要原因，仍有待深入研究。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用納米二氧化鈦的物理化學(xué)性質(zhì)

TiO2NPs, titanium dioxide nanoparticles.

我們的前期研究顯示，幼年大鼠相比成年大鼠對(duì)納米二氧化鈦的經(jīng)口暴露更加易感[15]，因此，本研究采用未成年的4周齡大鼠作為初始染毒對(duì)象。納米二氧化鈦經(jīng)食物攝入人體應(yīng)該是一個(gè)低劑量長(zhǎng)期暴露的過程，因此，本研究采用連續(xù)90 d每日灌胃的方法，探討經(jīng)口攝入不同劑量納米二氧化鈦和葡萄糖的亞慢性毒性試驗(yàn)對(duì)SD大鼠血清葉酸和維生素B12濃度的影響，結(jié)果顯示，納米二氧化鈦和葡萄糖連續(xù)經(jīng)口暴露90 d后可以明顯改變大鼠血清葉酸濃度，輕微改變維生素B12濃度。90 d染毒期結(jié)束時(shí)幼年大鼠已經(jīng)進(jìn)入成年期，尤其雌性大鼠已性成熟并可生育，如果此時(shí)雌性大鼠葉酸濃度降低，可能導(dǎo)致子代神經(jīng)管畸形的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。本研究結(jié)果顯示，在高糖攝入雌性大鼠中，納米二氧化鈦可以顯著降低血清葉酸濃度，這一結(jié)果提示，可能需要關(guān)注在高糖攝入兒童中納米二氧化鈦對(duì)其成年后葉酸濃度的影響以及伴隨的后期子代神經(jīng)管畸形風(fēng)險(xiǎn)。這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中納米二氧化鈦導(dǎo)致生殖發(fā)育毒性并進(jìn)而造成子代神經(jīng)系統(tǒng)損傷的報(bào)道一致[9]，但其具體機(jī)制以及其與納米二氧化鈦對(duì)葉酸濃度影響的因果關(guān)系尚不能確定。

納米二氧化鈦和葡萄糖聯(lián)合暴露對(duì)大鼠血清葉酸和維生素B12濃度產(chǎn)生改變的原因可能主要是其影響了肝臟代謝和腸道營(yíng)養(yǎng)吸收。肝臟是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的主要器官，葉酸和維生素B12均主要在肝臟代謝，此外，肝臟是納米二氧化鈦的經(jīng)口毒性靶器官[6]，高劑量葡萄糖經(jīng)口攝入也會(huì)對(duì)大鼠的肝臟功能產(chǎn)生影響[14]。因此，本研究中高劑量葡萄糖以及納米二氧化鈦+葡萄糖對(duì)大鼠血清葉酸和維生素B12水平的影響可能與其對(duì)肝臟代謝功能的影響密切相關(guān)。另外，前期研究顯示納米二氧化鈦經(jīng)口攝入誘導(dǎo)肝臟毒性存在性別差異，雌性更加敏感[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠血清葉酸水平對(duì)納米二氧化鈦和葡萄糖亞慢性暴露更加敏感。性激素的影響可能是造成這種性別差異的原因之一，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，納米二氧化鈦經(jīng)口攝入還可以對(duì)胃腸道產(chǎn)生損傷，影響其吸收功能[7]。小腸是葉酸和維生素B12的主要吸收部位，我們前期的研究已表明，納米二氧化鈦長(zhǎng)期經(jīng)口攝入可以對(duì)大鼠肝臟葡萄糖代謝和小腸葡萄糖吸收產(chǎn)生顯著影響[17]，提示納米二氧化鈦也可能通過這種途徑對(duì)葉酸和維生素B12濃度產(chǎn)生影響。

綜上所述，納米二氧化鈦與葡萄糖亞慢性聯(lián)合經(jīng)口暴露可以對(duì)幼年大鼠血清葉酸濃度產(chǎn)生影響，而且兩者存在拮抗作用，但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。納米二氧化鈦在高糖攝入幼年大鼠中降低葉酸濃度的效應(yīng)需引起關(guān)注。