李夢(mèng)華， 張瓅方

(1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，南陽(yáng) 473061；2.南陽(yáng)理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南陽(yáng) 473004)

由國(guó)家心血管中心發(fā)布的《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》中明確指出，中國(guó)成年人群中75%存有心血管問題，心血管患病人數(shù)接近3億人次，占據(jù)國(guó)內(nèi)居民因疾病死亡的40%以上，死亡率居首位。中國(guó)已經(jīng)成為全球心臟病死亡人數(shù)最多的國(guó)家[1-2]。心肌梗死(mycardial infarction,MI)是影響人類健康的重要疾病之一，中國(guó)自2002年開始MI死亡率就一直呈現(xiàn)快速上升態(tài)勢(shì)。雖然較早采取藥物溶栓、行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療等措施，MI死亡率有所下降，但部分患者在服藥或術(shù)后依然出現(xiàn)心室重塑(ventricular remodeling，VR)和心力衰竭(heart failure，HF)等并發(fā)癥[3]。MI早期發(fā)生的VR表現(xiàn)為梗死區(qū)心肌細(xì)胞出現(xiàn)炎癥壞死、結(jié)構(gòu)纖維化，隨著病情發(fā)展，波及到非梗死區(qū)心肌細(xì)胞代償性肥大、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)重建，加重心力衰竭甚至心臟破裂[4-5]。研究證實(shí)心肌炎癥、纖維化、凋亡及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是MI后心肌重塑的典型病理特征[6]，如何有效逆轉(zhuǎn)MI心室重塑，延緩MI導(dǎo)致的慢性心力衰竭，是近年來研究缺血性心臟病的熱點(diǎn)之一。早在東漢時(shí)期醫(yī)圣張仲景在《傷寒雜病論》中記載“干血不去，灌溉不周”，中醫(yī)認(rèn)為血脈循行依賴于氣的推動(dòng)，因此有著“氣為血之帥，血為氣之母”的理論闡釋。遍覽歷代中醫(yī)在治療血瘀、血虛等疾病時(shí)，多將補(bǔ)氣與活血藥物聯(lián)合使用。有研究統(tǒng)計(jì)，在治療心絞痛、心肌梗死、心律失常等血管病時(shí)，黃芪、丹參占據(jù)藥物使用頻率前十位，且協(xié)同使用時(shí)效果優(yōu)于單味藥物[7-8]。課題組前期通過黃芪丹參配伍提取物對(duì)MI模型大鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用可協(xié)同增強(qiáng)大鼠心臟舒縮功能，減少腦鈉尿鈦(brain natriuretic peptide,BNP)分泌，延緩心力衰竭[9]。在此工作基礎(chǔ)上，課題組假設(shè)黃芪丹參配伍提取物可改善MI心肌功能并抑制心肌重塑，繼續(xù)采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支復(fù)制MI大鼠模型，以研究黃芪丹參配伍提取物在體內(nèi)對(duì)MI的積極作用和機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性8周齡大鼠(200±20 g)，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(豫)2015-0005，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)1001297)，晝夜12 h交替飼養(yǎng)7 d(溫度26 ℃±1 ℃、濕度55%±10%)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方案均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》[10]執(zhí)行，并經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)的倫理準(zhǔn)則批準(zhǔn)進(jìn)行(批準(zhǔn)號(hào)：NYISTEEC-2017026)。

1.2 主要藥物、試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)中藥材由南陽(yáng)理工學(xué)院方藥研究所提供并鑒定蒙古黃芪干燥根經(jīng)和唇形科植物丹參干燥根經(jīng)，提取方法參照國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“黃芪丹參配伍提取物對(duì)心肌梗死后心室重構(gòu)中PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信號(hào)傳導(dǎo)通路影響的研究(81173372)”，黃芪每克含原生藥33.36 g，黃芪總苷含量70.8%，丹參每克含原生藥17.32 g，丹參總酚酸含量65.6%。腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog,Akt)、內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、兔抗多克隆抗體(Anti-GAPDH rabbit polyclonal antibody，GAPDH)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(福州市邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；動(dòng)物超聲成像儀(Vevo 3100，VisualSonics，Canda)；TKY-BMB石蠟包埋機(jī)、CUT6062病理切片機(jī)(深圳博大精科技實(shí)業(yè)有限公司)；熒光顯微鏡(DMIL-RF1，Leica,Germany)。

2 方法

2.1 建立MI大鼠模型

4%水合氯醛行腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)。大鼠胸毛備皮消毒后，在胸骨上緣正中1 cm處縱切行氣管插管，接通呼吸機(jī)以輔助呼吸。胸骨左緣第三肋間心尖搏動(dòng)處切口，鈍性依次分離肌層、胸膜，剪開心包膜后在左心耳右下緣中部和肺動(dòng)脈圓錐部結(jié)扎。以肉眼可見心尖部顏色改變，心電圖顯示II導(dǎo)聯(lián)QRS波群增寬、ST段弓背抬高，確定MI大鼠模型復(fù)制成功。假手術(shù)組穿線不結(jié)扎，大鼠模型成功后胸腔進(jìn)行分層封閉縫合，術(shù)后為預(yù)防感染連續(xù)3 d腹腔注射青霉素80萬單位。

2.2 分組及用藥

存活3 d的大鼠隨機(jī)分為黃芪丹參配伍提取物組[50 mg/(kg·d)]、假手術(shù)組(等量生理鹽水)、模型組(等量生理鹽水)各8只。尾靜脈注射給藥，連續(xù)3周后處死大鼠。

2.3 游泳疲勞時(shí)間

將大鼠置于自制水池中游泳(深度50 cm、面積1.5 m2、水溫30 ℃±1 ℃、)，游泳疲勞時(shí)間定義為大鼠在泳池中運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性降低，連續(xù)下沉3次以上。

2.4 超聲心動(dòng)圖測(cè)量

在藥物干預(yù)的1、10、21 d采用30 MHz中頻掃描頭的高頻超聲系統(tǒng)評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)和功能。大鼠采用4%水合氯醛麻醉后，進(jìn)行二維超聲心動(dòng)圖測(cè)量，記錄左室收縮末期直徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESd)、左室舒張末期直徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

2.5 Masson染色法測(cè)量心肌纖維化

采集心臟后使用磷酸鹽緩沖液清洗，固定于4%多聚甲醛。在不同濃度酒精脫水后嵌入石蠟包埋切片4 μm厚度。參照Masson操作說明持續(xù)染色處理，依次蘇木素染色、伊紅染色、苯胺藍(lán)復(fù)染后脫水封片。染色后心肌樣本中肌纖維呈現(xiàn)紅色，膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色。顯微鏡下成像，使用Image J軟件通過計(jì)算機(jī)平面測(cè)量法計(jì)算心肌纖維化。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定促炎因子

ELISA法檢測(cè)MI大鼠左心室心肌中TNF-α、TGF-β1、IL-1β的含量。取20 mg心肌樣品在200 μL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中均質(zhì)后置于-20 ℃儲(chǔ)存過夜。進(jìn)行凍融循環(huán)2次勻漿促使細(xì)胞膜破裂，5 000 r/min均速離心5 min后，按照試劑操作說明對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

2.7 TUNEL染色法測(cè)定凋亡細(xì)胞

采用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Bax蛋白和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的分布，心肌切片采用4’,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(dihydrochloride,DAPI)溶液染色評(píng)估細(xì)胞核形態(tài)。在熒光顯微鏡下放大400倍對(duì)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行成像，在每片梗死邊緣區(qū)隨機(jī)選取3層，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞凋亡總數(shù)，采用Image Pro Plus軟件進(jìn)行計(jì)算。

2.8 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分析

采用超聲、離心、熱變形等方法從MI大鼠左心室心肌組織中提取總蛋白。蛋白質(zhì)溶解物在12%聚丙烯酰胺凝膠電泳上電切分離后，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上。室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h后4 ℃冷藏用主要抗體培育過夜，包括兔抗Akt(1∶1 000)、兔抗磷酸Akt(1∶1 000)、兔抗eNOS(1∶1 000)、兔抗磷酸eNOS(1∶200)、兔抗NF-κB(1∶800)、兔抗Bax(1∶800)、兔抗Bcl-2(1∶800)、兔抗GAPDH(1∶1 000)。再將膜與辣根過氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體(1∶500)置于室溫下孵育1 h后洗膜，采用超信號(hào)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 MI模型大鼠游泳疲勞時(shí)間

與假手術(shù)組相比，模型組游泳一定時(shí)間后，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性明顯下降，出現(xiàn)疲勞時(shí)間較早(P<0.01)。與模型組相比，經(jīng)過中藥聯(lián)合干預(yù)后的黃芪丹參配伍提取物組游泳時(shí)對(duì)抗疲勞效果明顯，疲勞出現(xiàn)時(shí)間較晚(P<0.05)，如表1所示。

表1 各組MI大鼠游泳疲勞時(shí)間Table 1 Swimming fatigue time of MI rats in each

注：與假手術(shù)組相比**P<0.01，與模型組相比*P<0.05。

3.2 各組超聲心動(dòng)圖觀察

經(jīng)黃芪丹參配伍提取物干預(yù)后，超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示該藥對(duì)組合可顯著改善MI大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能。在藥物干預(yù)1 d，黃芪丹參配伍提取物組和模型組心功能相比較無明顯差異。在21 d，與假手術(shù)組相比，模型組LVESd和LVEDd升高明顯，而LVEF和LVFS明顯降低；與模型組相比，黃芪丹參配伍提取物組LVEF和LVFS顯著增高，LVESd和LVEDd明顯降低，如圖1所示。

3.3 心肌纖維化觀察

經(jīng)過Masson染色法檢測(cè)MI大鼠心肌纖維化表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)黃芪丹參配伍提取物可有效降低心肌纖維化。結(jié)果表明，假手術(shù)組紅色心肌組織排列較為規(guī)則清晰，心肌邊緣處伴有少量藍(lán)色膠原組織。與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織排列明顯紊亂，膠原纖維增多并已取代部分紅色壞死心肌。與模型組相比，黃芪丹參配伍提取物組心肌排列整齊度占比較高，膠原纖維明顯減少，如圖2所示。

3.4 炎癥細(xì)胞因子表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組中TNF-α、TGF-β1、IL-1β和NF-κB表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，說明心肌梗死后促炎細(xì)胞因子釋放增多。與模型組相比，TNF-α、TGF-β1、IL-1β和NF-κB表達(dá)顯著降低，有效抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，有利于MI的愈后，如圖3所示。

3.5 心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定

TUNEL染色后陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，經(jīng)DAPI復(fù)染后細(xì)胞核藍(lán)色。與假手術(shù)組相比，模型組心肌邊緣區(qū)域凋亡細(xì)胞明顯增多(P<0.05)。與模型組相比，經(jīng)中藥配伍聯(lián)合干預(yù)后的黃芪丹參配伍提取物組細(xì)胞凋亡顯著降低(P<0.05)。Western blot法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白含量結(jié)果顯示，與模型組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)以及Bax/Bcl-2比例均顯著增加(P<0.05)，如圖4所示。

與模型組相比*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，與假手術(shù)組相比++P<0.01、+++P<0.001、++++P<0.0001 圖1 各組MI大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果Fig.1 Echocardiographic results of MI rats in each group

3.6 Akt-eNOS信號(hào)表達(dá)

3組MI大鼠模型經(jīng)Western blot法檢測(cè)Akt-eNOS蛋白表達(dá)較相似。但與假手術(shù)組相比，模型組磷酸化Akt和磷酸化eNOS蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，黃芪丹參配伍提取物組可有效增加Akt和eNOS的磷酸化(P<0.05)，如圖5所示。

4 討論

在本次實(shí)驗(yàn)中，觀察了黃芪丹參配伍提取物對(duì)MI大鼠的心臟保護(hù)作用，得到以下結(jié)論。

(1)通過黃芪丹參配伍提取物干預(yù)后，可以提高M(jìn)I大鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，改善心肌結(jié)構(gòu)，減輕心肌纖維化和炎癥水平。

圖2 各組MI大鼠心肌纖維化影像(×200)Fig.2 Imaging myocardial fibrosis ofMI rats in each group(×200)

(2)通過提高Bcl-2和降低Bax蛋白含量發(fā)揮細(xì)胞抗凋亡作用，有效增加Akt-eNOS的磷酸化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪丹參配伍提取物能有效延緩MI后的心肌重塑進(jìn)展。

與模型組相比*P<0.05，與假手術(shù)組相比+P<0.01、++P<0.01、+++P<0.001 圖3 各組MI大鼠促炎細(xì)胞因子水平Fig.3 Levels of proinflammatory cytokines of MI rats in each group

與模型組相比*P<0.05，**P<0.01 圖4 各組MI大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平Fig.4 Apoptotic level of myocardial cells of MI rats in each group

與模型組相比*P<0.05 圖5 各組MI大鼠Akt-eNOS信號(hào)表達(dá)Fig.5 Akt-eNOS signal expression of MI rats in each group

炎癥細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β1、IL-1β在MI的心肌纖維化病理發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與誘導(dǎo)促炎細(xì)胞、內(nèi)皮黏附因子、氧化應(yīng)激酶等多個(gè)靶基因的表達(dá)?；罨腘F-κB通過促進(jìn)TNF-α、TGF-β1和IL-1β等表達(dá)激活心肌膠原纖維沉積，引發(fā)VR和HF，有研究報(bào)道通過抑制NF-κB能降低MI后的心肌損害[11]。在本次實(shí)驗(yàn)中再次證實(shí)了MI后可誘導(dǎo)TNF-α、TGF-β1和IL-1β的含量有所增加，采用黃芪丹參配伍提取物干預(yù)后明顯降低這些炎性標(biāo)志物的表達(dá)，說明黃芪丹參配伍提取物通過有效的抗炎作用有效保護(hù)心臟。心肌細(xì)胞的凋亡在MI和HF中起著重要作用，以往研究發(fā)現(xiàn)由缺血誘發(fā)的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致自噬心肌細(xì)胞死亡以及心肌細(xì)胞在心肌缺血損傷過程中的丟失[12]。細(xì)胞凋亡主要特點(diǎn)是促凋亡Bax家族蛋白表達(dá)增加和抗凋亡Bcl-2家族蛋白表達(dá)減少，同時(shí)Bcl-2蛋白還可抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性，說明細(xì)胞凋亡的擴(kuò)增會(huì)引發(fā)纖維化表現(xiàn)，心肌細(xì)胞的凋亡在心肌纖維化發(fā)展中起著重要作用。本次實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃芪丹參配伍提取物可顯著降低MI模型大鼠心肌邊緣區(qū)細(xì)胞凋亡水平，此外還能有效上調(diào)Bcl-2蛋白并抑制Bax蛋白表達(dá)，表明黃芪丹參配伍提取物可通過對(duì)抗細(xì)胞凋亡減少心肌重塑。一氧化氮(NO)是參與血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的重要因子之一，eNOS作為維護(hù)血管內(nèi)皮功能穩(wěn)定的標(biāo)志，在維持血管內(nèi)皮完整性、血管舒張性和血管生成中具有重要作用。Akt和eNOS磷酸化通路途徑的激活能積極促進(jìn)NO的合成，通過調(diào)節(jié)血管重構(gòu)和血管生成保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[13]，如eNOS缺乏則可引起心肌細(xì)胞凋亡引發(fā)心力衰竭。本次實(shí)驗(yàn)研究觀察到黃芪丹參配伍提取物可明顯誘導(dǎo)MI大鼠模型心肌組織中Akt和eNOS磷酸化，表明通過該中藥組合配伍干預(yù)后可通過激活A(yù)kt/eNOS通路對(duì)缺血性心肌組織產(chǎn)生積極的保護(hù)作用。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)研究表明黃芪丹參配伍提取物可有效預(yù)防MI后的心肌重塑，其潛在機(jī)制可能與抗炎、抗纖維化、對(duì)抗細(xì)胞凋亡和維護(hù)血管內(nèi)皮功能穩(wěn)定性有直接關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中使用黃芪丹參配伍提取物顯著改善了MI模型大鼠左心室形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，但仍存在觀察周期較短，能否聯(lián)合其他藥物方法配伍使用，尚需進(jìn)一步觀察揭示更多的作用途徑。鑒于黃芪丹參配伍對(duì)缺血性心肌的保護(hù)作用認(rèn)識(shí)不斷加深，此藥將作為新的治療方法繼續(xù)深入研究。