賈茹，孫媛媛，富偉能

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122）

喉鱗狀細(xì)胞癌 （laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC） 是常見(jiàn)的喉癌［1］，其細(xì)胞起源于喉上皮細(xì)胞。研究［1］顯示LSCC的5年生存率僅為60%左右，主要死亡原因是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［2］。因此，研究喉癌細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的理論意義和潛在臨床價(jià)值。高遷移率族蛋白B-1 （high mobility group box-1，HMGB1） 是核DNA結(jié)合蛋白，含有2個(gè)DNA結(jié)合區(qū) （boxA、boxB） 和1個(gè)酸性C末端區(qū)［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)HMGB1促進(jìn)細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移，說(shuō)明其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。有研究［5］證實(shí)乳腺癌中miR-200c可以通過(guò)調(diào)控HMGB1的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移；在直腸癌中沉默HMGB1后腫瘤細(xì)胞遷移能力減弱［6］，但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。細(xì)絲蛋白A （filamin A，F(xiàn)LNA） 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞骨架蛋白［7］。有研究［8］證實(shí)FLNA在多種腫瘤細(xì)胞 （乳腺癌等） 中表達(dá)，但其在喉癌細(xì)胞系Hep2中的生物學(xué)功能尚不明確。研究［9］發(fā)現(xiàn)在FLNA啟動(dòng)子區(qū)存在2個(gè)HMGB1的潛在結(jié)合位點(diǎn) （5'-A/TAACAAT/A-3'） 。因此推測(cè)HMGB1可能通過(guò)調(diào)控FLNA發(fā)揮癌基因作用。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)喉癌及癌旁組織中FLNA表達(dá)水平及其對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞遷移能力的影響，初步探討HMGB1基因在喉癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制及生物學(xué)功能，為喉癌的分子診治提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源：選取解放軍第463醫(yī)院耳鼻咽喉科30例喉癌患者術(shù)后組織標(biāo)本，同時(shí)選取對(duì)應(yīng)癌旁組織 （距癌組織切緣＞2 cm） 作為對(duì)照組，選取的組織標(biāo)本均經(jīng)病理科確診為L(zhǎng)SCC，并具有完整臨床樣本信息，所有患者均知情同意。

1.1.2 細(xì)胞株及試劑：人胚腎細(xì)胞系HEK293 （中科院上海細(xì)胞庫(kù)）、人喉癌Hep-2細(xì)胞 （中科院上海細(xì)胞庫(kù)） 。胎牛血清 （中國(guó)BI公司）、1640培養(yǎng)基 （中國(guó)BI公司）、TRIzol （日本TaKaRa公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR相關(guān)試劑 （日本TaKaRa公司），RIPA裂解液 （強(qiáng)） （碧云天生物技術(shù)公司）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 （碧云天生物技術(shù)公司）、Transwell小室 （法國(guó)Coster公司）、結(jié)晶紫 （碧云天生物技術(shù)公司）、Polyplus轉(zhuǎn)染試劑 （美國(guó)Afao公司）、FLNA蛋白抗體（武漢三鷹生物技術(shù)公司）、HMGB1-siRNA和FLNAsiRNA （上海吉?jiǎng)P公司） 。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

提前24 h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep2細(xì)胞以2×105/mL密度鋪于6孔板中。隨機(jī)分為空白對(duì)照組 （CON組）、陰性對(duì)照組 （NC組）、HMGB1-siRNA組、FLNA-siRNA 組以及 HMGB1-siRNA+FLNA-siRNA組，然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞完全貼壁時(shí)，轉(zhuǎn)染相關(guān)小RNA （NC、HMGB1、FLNA） 和轉(zhuǎn)染試劑。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間點(diǎn)收集轉(zhuǎn)染后的Hep2細(xì)胞。

1.3 cDNA合成和實(shí)時(shí)定量PCR

使用PrimeSciptTMRT Master Mix Kit試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：FLNA，上游引物5’-GACAGGTCGCTACACCATC C-3’，下游引物5’-CTAGCCCGTGACCTCCGATT-3’；GAPDH，上游引物5’-TAACATCAAATGGGGTGAG G-3’，下游引物5’-GGTTCACACCCATCACAAAC-3’。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，反應(yīng)結(jié)果用BIO-RAD CFX Connect Real-Time System軟件分析，并計(jì)算每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) （cycle threshold，Ct） 值。采用2-ΔΔCt計(jì)算喉癌及癌旁組織拷貝數(shù)的差異。

1.4 Western blotting檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染48 h后NC組及HMGB1-siRNA組喉癌Hep2細(xì)胞，加RIPA裂解液冰浴30 min，提取喉癌細(xì)胞總蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，檢測(cè)蛋白濃度后，將其調(diào)整至相同濃度，每孔加入35 μg蛋白上樣。將蛋白SDS-PAGE電泳分離1.5 h、恒流300 mA電轉(zhuǎn)2 h、5%脫脂牛奶封閉2 h、用TBST洗滌3次后，放入1 ∶1 000稀釋的FLNA一抗中搖床上4 ℃雜交過(guò)夜、次日取出后，用TBST洗滌3次后放入二抗中，37 ℃溫箱中孵育1 h、用TBST洗滌3次后采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。BioRad圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶吸光度，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白吸光度值/GAPDH蛋白吸光度值。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

收集各轉(zhuǎn)染組48 h細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，以1×104/mL密度接種于6孔板，接種24 h后，在6孔板中劃痕，PBS沖洗3次，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，分別于劃痕后0、24、48 h觀察細(xì)胞的遷移情況并拍照記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，以細(xì)胞密度3×104/孔接種于Transwell小室上層中 （加入終體積200 μL雙無(wú)1640培養(yǎng)基），小室下層加入600 μL10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，依次進(jìn)行PBS沖洗、4%多聚甲醛固定30 min、結(jié)晶紫染色30 min、PBS沖洗后用小刀將濾膜切下、中性樹(shù)脂封片、顯微鏡計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FLNA在喉癌組織及喉癌Hep2細(xì)胞中低表達(dá)

應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)FLNA基因在30例喉癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)LNA在11例 （36.7%） 癌組織中高表達(dá)。30例喉癌患者組織中FLNAmRNA表達(dá)量 （0.632±0.057） 顯著低于癌旁組織 （1.000±0.0，P＜ 0.01） ；應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR方法比較人胚腎細(xì)胞HEK293和喉癌Hep2細(xì)胞中FLNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示FLNA在HEK293細(xì)胞中表達(dá)水平 （1.000±0.0） 高于喉癌Hep2細(xì)胞 （0.512±0.094，P＜0.05） 。提示FLNA在喉癌中發(fā)揮抑癌基因作用。

2.2 HMGB1-siRNA抑制喉癌Hep2細(xì)胞HMGB1表達(dá)

轉(zhuǎn)染siHMGB1至喉癌Hep2細(xì)胞48 h后，應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)HMGB1表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HMGB1-siRNA后，Hep2細(xì)胞中HMGB1mRNA表達(dá) （0.210 2±0.088 47） 顯著低于對(duì)照組 （1.000 0±0.0，P＜ 0.001），說(shuō)明HMGB1-siRNA能有效抑制喉癌Hep2細(xì)胞HMGB1的表達(dá)，證明轉(zhuǎn)染有效。

2.3 HMGB1基因沉默上調(diào)喉癌Hep2細(xì)胞中FLNA表達(dá)

轉(zhuǎn)染了HMGB1-siRNA后，應(yīng)用Western blotting和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Hep2細(xì)胞中FLNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HMGB1-siRNA組中FLNAmRNA和蛋白水平均顯著高于對(duì)照組 （P＜ 0.05），見(jiàn)表1、圖1。提示HMGB1基因沉默上調(diào)喉癌Hep2細(xì)胞中FLNA的表達(dá)，HMGB1負(fù)性調(diào)控FLNA。

表1 各組FLNA mRNA和蛋白表達(dá)比較Tab.1 Comparison of FLNA mRNA and protein expression in each group

圖1 HMGB1基因沉默上調(diào)喉癌Hep2細(xì)胞中FLNA表達(dá)Fig.1 HMGB1 silencing upregulated FLNA expression in laryngeal cancer Hep2 cells

2.4 HMGB1通過(guò)FLNA促進(jìn)喉癌Hep2細(xì)胞遷移（表2、圖2）

將FLNA-siRNA以及HMGB1-siRNA+FLNA-siRNA轉(zhuǎn)染喉癌Hep2細(xì)胞48 h后，應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)FLNAmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與FLNA-siRNA組 （0.188 8±0.066 31） 比較，HMGB1-siRNA+FLNA-siRNA組 （0.511 9±0.094 03）FLNAmRNA表達(dá)升高 （P＜ 0.001），證明轉(zhuǎn)染有效。同時(shí)，HMGB1-siRNA、FLNA-siRNA以及HMGB1-siRNA+FLNA-siRNA共轉(zhuǎn)染喉癌Hep2細(xì)胞48 h后，采用劃痕以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HMGB1-siRNA組遷移距離和數(shù)量明顯低于NC組及對(duì)照組 （P＜ 0.01），轉(zhuǎn)染FLNA-siRNA組遷移距離和數(shù)量明顯高于NC組及對(duì)照組（P＜ 0.01） 。轉(zhuǎn) 染HMGB1-siRNA+FLNA-siRNA組 與HMGB1-siRNA組相比，遷移能力明顯升高 （P＜ 0.05） 。提示FLNA-siRNA可逆轉(zhuǎn)HMGB1-siRNA對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用，即FLNA介導(dǎo)HMGB1抑制喉癌Hep2細(xì)胞遷移。

表2 各組Hep2細(xì)胞遷移距離和數(shù)量比較Tab.2 Comparison of the migration distance and number of migrated Hep2 cells in each group

圖2 HMGB1 FLNA促進(jìn)喉癌Hep2細(xì)胞遷移Fig.2 HMGB1 promotes the migration of laryngeal cancer Hep2 cells by FLNA

2.5 喉癌組織中FLNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，F(xiàn)LNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和腫瘤分化程度密切相關(guān) （P＜ 0.05），而與患者年齡、性別等因素不相關(guān) （P＞ 0.05），見(jiàn)表3。

表3 FLNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between FLNA expression and clinicopathological characteristics of laryngeal cancer patients

3 討論

FLNA 編碼產(chǎn)物為一種細(xì)絲蛋白，是一種腳手架蛋白，可與肌動(dòng)蛋白細(xì)絲交聯(lián)，引導(dǎo)其與細(xì)胞膜上糖蛋白結(jié)合，引起細(xì)胞形狀改變和遷移，在維持并穩(wěn)定細(xì)胞骨架、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用［10］。

HMGB蛋白家族包含HMGB1、HMGB2和HMGB3 3種亞型蛋白，HMGB1是HMGB家族的重要成員［11］。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)喉癌組織及癌旁組織中FLNA基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)喉癌中FLNA基因表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，且與喉癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及腫瘤分化程度有關(guān)。提示FLNA在喉癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在FLNA啟動(dòng)子區(qū)存在潛在結(jié)合位點(diǎn)［9］，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染HMGB1特異性siRNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明喉癌Hep2細(xì)胞中HMGB1沉默后FLNA表達(dá)上調(diào)，提示FLNA是HMGB1下游靶基因。

基于HMGB1在腫瘤中的重要作用，推測(cè)FLNA也可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性有影響。因此本研究采用劃痕、Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了HMGB1、FLNA對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞遷移和遷移的影響。結(jié)果顯示，下調(diào)HMGB1表達(dá)后細(xì)胞遷移能力降低，且這種影響可被FLNA回復(fù)，提示HMGB1促進(jìn)喉癌細(xì)胞遷移是通過(guò)調(diào)控FLNA實(shí)現(xiàn)的。FLNA作為一種新型腫瘤標(biāo)志物，研究［12］已發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中的表達(dá)顯著降低，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)。然而FLNA在調(diào)控喉癌細(xì)胞遷移的具體機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究論證。

綜上所述，HMGB1通過(guò)抑制FLNA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)喉癌細(xì)胞遷移。本研究以喉癌Hep2細(xì)胞為研究對(duì)象，首次報(bào)道了FLNA對(duì)喉癌遷移的影響及其初步機(jī)制，為喉癌分子靶向治療的研究提供了新線索。