張海濤，韋薇，齊弘煒，袁彪，湯楚中

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟外科，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液檢驗(yàn)室，河北 承德 067000；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院心臟外科，北京 100730；4.中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心心臟外科，北京 100048）

缺血性心臟病是最嚴(yán)重的心血管疾病之一，其病理生理機(jī)制以及心肌細(xì)胞缺血適應(yīng)機(jī)制尚未完全闡明。有證據(jù)表明，微小RNA （microRNA，miRNA）可能在缺血性心臟病中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1-2］。miRNA是一類在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮功能的非編碼小RNA，miRNA在缺血性心臟病發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展的過程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［3-4］。miR-486是心臟高豐度表達(dá)的重要miRNA之一，有研究［5］表明，miR-486在攜帶MRTF-A重組腺病毒轉(zhuǎn)染的新生大鼠心肌細(xì)胞表達(dá)的多種miRNA中最為突出。而MRTF-A在心肌缺血期間，是調(diào)控心肌細(xì)胞纖維化的重要轉(zhuǎn)錄因子。因此，miR-486的表達(dá)調(diào)控與心肌缺血和預(yù)后有明顯相關(guān)性，但是miR-486在心肌細(xì)胞中的作用目前尚不清楚。因此，本研究擬利用腺病毒介導(dǎo)的基因高表達(dá)和沉默技術(shù)，初步研究miR-486在心肌細(xì)胞缺氧損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

1～2日齡的清潔級SD大鼠乳鼠15只，購于北京科宇動物養(yǎng)殖中心。

1.2 主要試劑和儀器

miRNA提取試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA-486熒光探針、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 （美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），腺病毒ad-miR-486、腺病毒admiR-486-antago （上海漢恒生物公司），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH） 試劑盒 （南京建成生物工程研究所有限公司），CCK-8試劑盒 （中國東仁化學(xué)科技有限公司），AnnexinⅤ/PI試劑盒 （武漢博士德生物工程有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱、紫外分光光度計(jì)（美國賽默飛世爾科技有限公司），低氧培養(yǎng)箱 （英國Ruskinn公司），酶標(biāo)儀 （美國分子儀器公司），流式細(xì)胞儀 （美國BD公司）。

1.3 乳鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取出生1～2 d的SD大鼠乳鼠15只，消毒后在無菌條件下取出乳鼠心臟，除去心包等多余組織，將心室剪成約1 mm3均勻大小的組織塊，并用0.125%胰蛋白酶在37 ℃水浴鍋中重復(fù)消化4次 （每次約10 min）。吸取后3次消化的細(xì)胞懸液于離心管內(nèi)，添加含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。離心后去上清液，將細(xì)胞懸液重新懸浮到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，均勻接種于75 mL的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃培養(yǎng)箱（含5% CO2和95% O2）中培養(yǎng)，差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于培養(yǎng)板上，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱 （含5% CO2和95%空氣） 中繼續(xù)培養(yǎng)，孵育36 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞miR-486水平

制備單細(xì)胞懸液接種于6孔板，1×105/孔。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時(shí)，將細(xì)胞分成6組，分別為常氧培養(yǎng)對照組、低氧培養(yǎng)6 h組、低氧培養(yǎng)12 h組、低氧培養(yǎng)24 h組、低氧培養(yǎng)36 h組、低氧培養(yǎng)48 h組，取各組細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基后，按照 ABI miRNA 分離試劑盒說明書操作，提取miRNA，紫外分光光度計(jì)測定miRNA濃度和純度，采用U6作為內(nèi)參，用特異性miR-486反轉(zhuǎn)錄引物和U6內(nèi)參反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。用ABI公司的miR-486探針對原代心肌細(xì)胞中miR-486的表達(dá)進(jìn)行測定。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 （ABI 7900，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司） 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得Ct值后，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞活力、損傷和凋亡程度的測定

將1.4中達(dá)到80%融合度的心肌細(xì)胞按照轉(zhuǎn)染Ad-miR-486和Ad-miR-486-antago，分成6組，分別為常氧培養(yǎng)組 （C+N組）、轉(zhuǎn)染ad-miR-486+常氧培養(yǎng)組（M+N組）、轉(zhuǎn)染ad-miR-486-antago+常氧培養(yǎng)組 （I+N組）、低氧培養(yǎng)組 （C+H組）、轉(zhuǎn)染ad-miR-486+低氧培養(yǎng)組 （M+H組）、轉(zhuǎn)染ad-miR-486-antago+低氧培養(yǎng)組（I+H組），用無血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液分別稀釋待轉(zhuǎn)染的ad-miR-486和ad-miR-486-antago。將脂質(zhì)體Lipofectamine 2000與待轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫靜置20 min后，加入相對應(yīng)的各組細(xì)胞中。C+N組、M+N組、I+N組置于常氧培養(yǎng)箱 （37 ℃，含5% CO2和95%空氣） 中孵育；C+H組、M+H組、I+H組置于低氧培養(yǎng)箱 （37 ℃，含1% O2、94% N2和5% CO2） 中孵育。48 h后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行下列指標(biāo)的檢測。

1.5.1 CCK-8法測定心肌細(xì)胞活性：隨機(jī)選取各組心肌細(xì)胞，每孔培養(yǎng)基按照10 ∶1的比例避光加入CCK-8試劑，37 ℃下在培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)3 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定光密度 （optical density，OD） 值，間接反映心肌細(xì)胞活力。計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力 （%）=（OD實(shí)驗(yàn)孔-OD調(diào)零孔）/ （OD常氧培養(yǎng)孔-OD調(diào)零孔） ×100。

1.5.2 培養(yǎng)液LDH活性的測定：吸取各組細(xì)胞上清液，按照LDH活性檢測試劑盒說明，用酶標(biāo)儀測定各組還原型輔酶Ⅰ在反應(yīng)過程中340 nm處OD值，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性。

1.5.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡：吸凈各組細(xì)胞培養(yǎng)液，加入不含EDTA的0.25%胰酶消化至細(xì)胞形態(tài)為圓形時(shí)，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS漂洗2次后，用300 μL的1×Binding buffer重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度約1×105/mL，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶，混勻后避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞miR-486表達(dá)水平的變化

從SD大鼠乳鼠中分離心肌細(xì)胞并培養(yǎng)擴(kuò)增，依次于低氧培養(yǎng)箱 （37 ℃，1% O2、94% N2、5% CO2）中培養(yǎng)6、12、24、36、48 h后收取，抽提細(xì)胞RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定miR-486表達(dá)變化。常氧培養(yǎng)對照組、低氧培養(yǎng)6 h組、低氧培養(yǎng)12 h組、低氧培養(yǎng)24 h組、低氧培養(yǎng)36 h組、低氧培養(yǎng)48 h組中，miR-486的表達(dá)水平分別為1.03±0.27、1.16±0.22、1.65±0.31、2.52±0.72、1.66±0.24、1.45±0.04。隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長，miR-486的表達(dá)逐漸上升，至24 h達(dá)到峰值后逐漸下降，低氧培養(yǎng)12、24、36 h組miR-486表達(dá)量明顯高于常氧培養(yǎng)對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。

2.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性的比較

6組比較，心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=72.759，P＜ 0.01）。心肌細(xì)胞在常氧環(huán)境中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染ad-miR-486和ad-miR-486-antago可略增加LDH釋放量，但M+N組、I+N組與C+N組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05）。低氧環(huán)境中培養(yǎng)的心肌細(xì)胞 （C+H組、M+H組、I+H組） 較常氧環(huán)境中心肌細(xì)胞 （C+N組、M+N組、I+N組） LDH釋放量明顯增加（P＜ 0.05）。在低氧環(huán)境中轉(zhuǎn)染了ad-miR-486的M+H組較C+H組、I+H組LDH釋放量明顯下降 （P＜ 0.05），且轉(zhuǎn)染了ad-miR-486-antago的I+H組LDH釋放量高于C+H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05），見表1。

2.3 心肌細(xì)胞活力的比較

6組比較，心肌細(xì)胞活力的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.384，P＜ 0.01）。低氧環(huán)境中C+H組和I+H組較其他4組心肌細(xì)胞活力明顯降低 （P＜ 0.05），且轉(zhuǎn)染了ad-miR-486的M+H組較C+H組、I+H組心肌細(xì)胞活力明顯升高 （P＜ 0.05），轉(zhuǎn)染了ad-miR-486-antago的I+H組較C+H組心肌細(xì)胞活力明顯下降 （P＜0.05）。見表1。

2.4 各組心肌細(xì)胞凋亡率的比較

6組比較，心肌細(xì)胞凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=80.302，P＜ 0.01）。常氧環(huán)境中轉(zhuǎn)染admiR-486和ad-miR-486-antago可略增加心肌細(xì)胞的凋亡率，但M+N組、I+N組與C+N組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05）。低氧環(huán)境中培養(yǎng)的心肌細(xì)胞 （C+H組、M+H組、I+H組） 較在常氧環(huán)境中心肌細(xì)胞 （C+N組、M+N組、I+N組） 凋亡率明顯升高 （P＜ 0.05）。在低氧環(huán)境中轉(zhuǎn)染了ad-miR-486-antago的I+H組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于C+H組和M+H組 （P＜ 0.05），且轉(zhuǎn)染了ad-miR-486的M+H組細(xì)胞凋亡率明顯小于C+H組 （P＜ 0.05）。見表1、圖1。

3 討論

缺血性心臟病的主要病理過程是由于血管病變導(dǎo)致心臟血供障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血、損傷和凋亡，最終導(dǎo)致心臟功能受損。而miRNA在這個(gè)過程中起重要作用，miRNA失調(diào)與缺血性心臟病的發(fā)生和發(fā)病機(jī)制有關(guān)［6-8］。研究［9］表明，通過提高大鼠心肌中miR-486的表達(dá)水平，可以改善大鼠心肌梗死后心臟功能。本研究通過對大鼠原代心肌細(xì)胞低氧培養(yǎng)，模擬了心肌急性缺氧損傷的過程，利用腺病毒介導(dǎo)的基因高表達(dá)和沉默技術(shù)，提高和降低了心肌細(xì)胞中miR-486的表達(dá)水平，并通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)低氧條件下miR-486能夠降低LDH活性、增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力、降低細(xì)胞凋亡率，從而改善低氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷和凋亡。

本研究證實(shí)miR-486是心肌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)的miRNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)在低氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞內(nèi)miR-486表達(dá)顯著提高，但其對心肌細(xì)胞低氧損傷過程的保護(hù)機(jī)制尚不明確。利用TargetScan網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析，預(yù)測miR-486的靶基因可能含有PTEN、FoxO1、Sirt1。其中，PTEN作為H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子［10］，miR-486-5p可通過靶向抑制PTEN并激活PI3K/AKT信號通路來保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡［11］。FoxO家族參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，F(xiàn)oxO1通過轉(zhuǎn)錄控制丙酮酸脫氫酶激酶4的表達(dá)，調(diào)節(jié)心肌葡萄糖氧化速率［12］，其抑制作用也顯著抑制成肌細(xì)胞增殖和減少成肌細(xì)胞凋亡［13］。Sirt1失活在缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用［14］。因此，這些靶基因的抑制可能涉及miR-486對心肌細(xì)胞低氧損傷的保護(hù)作用。這在本研究中也得到了證實(shí)，低氧環(huán)境中，與C+H組比較，M+H組LDH釋放和細(xì)胞凋亡率明顯下降，細(xì)胞活力明顯上升；而I+H組LDH釋放明顯增多，細(xì)胞凋亡率明顯上升，細(xì)胞活力明顯降低?？梢?，miR-486對低氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷和凋亡的改善是有效的。

表1 6組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性、細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率的比較Tab.1 Comparison of LDH activity，cell viability，and rate of apoptosis in the culture fluid of the cardiomyocytes among the six groups

圖1 流式細(xì)胞儀測定心肌細(xì)胞凋亡率Fig.1 Determination of the rate of apoptosis of the cardiomyocytes using flow cytometry

綜上，本研究表明，miR-486對原代心肌細(xì)胞低氧狀態(tài)下的損傷和凋亡有顯著改善作用。miR-486可能為缺血性心臟病的基因治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。