史傳奇，胡寶忠，于少鵬，孟 博，楊春雪，劉 嘉，丁俊男

(哈爾濱學(xué)院 黑龍江省寒區(qū)濕地生態(tài)與環(huán)境研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱濕地研究院， 黑龍江 哈爾濱 150086)

沉水植物可以通過富集作用去除水體污染物，同時(shí)提高微生物多樣性、豐度與活性，使水體生態(tài)得以修復(fù)[1]。金魚藻(CeratophyllumdemersumL.)為金魚藻科(Ceratophyllaceae)多年生沉水無根植物，世界范圍均有分布[2]。王丹等[3]提出金魚藻對(duì)污染水體中總氮(total nitrogen， TN)、總磷(total phosphorus， TP)、化學(xué)需氧量具有良好的去除效果。Foroughi等[4]研究表明，金魚藻可吸收廢水中N、P元素以達(dá)到凈化作用。譚洪濤等[5]利用金魚藻處理生活污水至28 d，TN、TP去除率達(dá)到88.6%、86.9%。姜小玉等[6]研究表明，金魚藻的加入，可有效提高控藻效果，減少水中N、P含量，長期有效地改善水質(zhì)。

水體微生物以變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)等為優(yōu)勢類群[7-11]，也包括古細(xì)菌[12-13]。水體環(huán)境中，微生物存在于沉水植物根際和葉面形成多孔網(wǎng)狀黏液質(zhì)的“生物膜”中[14-15]，可利用植物提供的有機(jī)碳源和氧氣，參與植物礦質(zhì)元素交換[16-18]。兩者的互利關(guān)系易受到環(huán)境因子的影響而改變微生物群落結(jié)構(gòu)，如pH值、溶解氧(dissolved oxygen， DO)含量、營養(yǎng)物質(zhì)等[14-15，19-21]。不同水生植物表面可附著不同的微生物以組建不同的群落結(jié)構(gòu)[14，22]，可通過PCR-DGGE、T-RFLP、16S rDNA片段擴(kuò)增、宏基因組等技術(shù)獲取其群落結(jié)構(gòu)與多樣性特征[1，17，23-24]，用于進(jìn)一步分析兩者間，以及環(huán)境因子間的相關(guān)性，以便更高效地修復(fù)水體生態(tài)環(huán)境[25]。

黑龍江省位于我國最北方，擁有豐富的寒區(qū)濕地資源，寒區(qū)濕地在氣候調(diào)節(jié)、碳匯、水分平衡和生物多樣性保護(hù)等方面均發(fā)揮著重要作用[26]。然而，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用化肥容易導(dǎo)致濕地水體N、P污染[27-28]。尤其是黑龍江省結(jié)冰期較長，導(dǎo)致在自然條件下水體凈化能力達(dá)不到理想效果，開展針對(duì)微生物-植物聯(lián)合凈化寒區(qū)濕地水體的研究顯得十分重要。本研究在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)利用金魚藻，在不同種植密度、不同曝氣條件下對(duì)水體TN、TP進(jìn)行去除；同時(shí)，利用高通量測序技術(shù)測定不同階段水體微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性，為寒區(qū)靜水濕地水體凈化研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為今后探明微生物-植物聯(lián)合凈化寒區(qū)濕地水體的機(jī)制和篩選功能微生物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 野外采集與實(shí)驗(yàn)設(shè)置

水體樣品于2018年7月29日取自于黑龍江省哈爾濱市民主鄉(xiāng)施肥后的水稻田排水口處，實(shí)地取樣時(shí)水體溫度(20.2±1.3)℃、pH 6.59±0.10、DO含量(6.42±0.25)mg·L-1，TN濃度(8.65±0.05)mg·L-1，TP濃度(2.39±0.04)mg·L-1。底泥0～5 cm處取100 g，3次重復(fù)，充分混勻，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)設(shè)置對(duì)照組(A組)和5個(gè)處理組(B～F組)，每組各重復(fù)3次。將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)已用蒸餾水培養(yǎng)3 d、生長良好的金魚藻用蒸餾水漂洗3次，置于篩網(wǎng)上至無水滴連續(xù)滴落時(shí)稱量，B組、C組、E組各投加200 g(種植密度D為4.44 g·L-1)，D組、F組各投加400 g(D為8.89 g·L-1)，各組均放置于玻璃容器(長×寬×高=50 cm × 30 cm × 40 cm)中，用18 L蒸餾水將底泥充分稀釋，每個(gè)容器中加入1 L，再分別加入水體樣品至水位高30 cm (45 L)，實(shí)驗(yàn)過程中加入蒸餾水以保持各容器內(nèi)水量不變。曝氣處理組使用流量為50 L·min-1的曝氣泵(森森ACO-003電磁式空氣泵)，每個(gè)曝氣泵連接4個(gè)微孔曝氣頭，安裝于玻璃容器的4個(gè)底角處。處理設(shè)計(jì)如表1。

1.2 室內(nèi)取樣與測定

水體樣品取樣共3次，分別于7月30日、8月10日、8月21日10:00進(jìn)行，編號(hào)為A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D3、E1～E3、F1～F3。各玻璃容器內(nèi)取1.0 L水體樣品，采用0.22 μm孔徑聚碳酸酯濾膜進(jìn)行抽濾(每次抽濾前裝置用蒸餾水清洗3次，抽濾后將水體樣品倒回原玻璃容器)，共獲得54個(gè)水體微生物樣品，低溫保存送上海天昊生物技術(shù)服務(wù)公司，進(jìn)行微生物DNA提取，利用Illumina PE150測序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌V4-V5區(qū)進(jìn)行高通量測序。測定各玻璃容器內(nèi)液面下10 cm處pH(雷磁PHB-4 pH計(jì))、DO含量和水體溫度(衡欣AZ8403溶解氧儀)，每個(gè)指標(biāo)測定重復(fù)3次。清除植株殘?bào)w，于水體液面下5 cm處取樣，每玻璃容器中重復(fù)3次，分別裝入100 mL試管中。采用過硫酸鉀消解紫外分光光度法(GB 11894—1989)測定TN濃度，鉬酸銨分光光度法(GB 11893—1989)測定TP濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 17.0進(jìn)行Duncan多重比較，分析不同處理間TN、TP去除率的差異顯著性，去除率(%)=(第1次取樣時(shí)濃度-第3次取樣時(shí)濃度)/第1次取樣時(shí)濃度×100。得到水體樣品微生物優(yōu)化序列，在97%相似度水平下聚類為操作分類單位(operational taxonomic units，OTU)，統(tǒng)計(jì)各樣品中OTU的相對(duì)豐度信息，計(jì)算每組3次重復(fù)的平均值。利用Mothur v.1.39.5軟件分析微生物群落Chao 1豐富度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)。Office Excel 2010繪制門水平的群落結(jié)構(gòu)柱狀圖，SPSS 17.0進(jìn)行Duncan多重比較，分析門、屬水平優(yōu)勢類群相對(duì)豐度與多樣性指數(shù)的差異顯著性。利用Canoco for Windows 4.5對(duì)OTU水平做主成分分析(principle component analysis， PCA)，并分別對(duì)門和屬水平優(yōu)勢類群相對(duì)豐度矩陣做去趨勢對(duì)應(yīng)分析(detrended correspondence analysis，DCA)，根據(jù)DCA結(jié)果中梯度長度在第一軸上的值，選擇典范對(duì)應(yīng)分析或冗余分析(redundancy analysis，RDA)，分析微生物群落與理化因子間相關(guān)性，利用Monte Carlo置換檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)理化因子對(duì)微生物群落影響的顯著性，置換次數(shù)為999，并利用CanoDraw for windows 4.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體樣品理化因子檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)樣品取樣時(shí)水體溫度和pH(6.64±0.04)變化程度較小，且無明顯規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各處理組金魚藻質(zhì)量變化差異不顯著(P>0.05)。DO含量具有較大差異，如表2，B組、C組和D組DO含量均高于A組，說明取樣時(shí)金魚藻可通過光合作用釋放氧氣，增加水體DO含量，而取樣時(shí)E、F組仍在進(jìn)行曝氣，其DO含量高于其余組，接近飽和狀態(tài)。

與A組相比，B～F處理組的TN、TP均有極顯著(P<0.01)下降。C組和D組處理?xiàng)l件下TN的去除效果最好，即12 h曝氣條件下金魚藻對(duì)TN的去除效果最好。進(jìn)一步從C組和D組、E組和F組比較中可以看出，相同曝氣處理?xiàng)l件下提高金魚藻種植密度未顯著(P>0.05)提高TN去除效果。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table 1 Experimental setting

處理Treatment金魚藻質(zhì)量Mass of C. demersum/g種植密度Planting density/(g·L-1)曝氣時(shí)間Aeration time/hA000B2004.440C2004.4412 (18:00～次日06:00) 12 (from 18:00 to 06:00 the next day)D4008.8912 (18:00～次日06:00) 12 (from 18:00 to 06:00 the next day)E2004.4424F4008.8924

表2 不同處理?xiàng)l件下水體樣品理化因子

Table 2 Physicochemical factors of water samples under different treatments

處理Treatment樣品Sample溶解氧Dissolved oxygen/(mg·L-1)總氮TN/(mg·L-1)總氮去除率TN removal rate/%總磷TP/(mg·L-1)總磷去除率TP removal rate/%AA16.05±0.038.62±0.093.21±0.67 dD2.36±0.0317.10±2.91 dCA25.74±0.038.45±0.062.09±0.05A35.53±0.038.34±0.041.96±0.08BB17.77±0.048.54±0.3421.09±4.53 cC2.38±0.0260.77±3.36 cBB27.85±0.057.52±0.151.83±0.14B37.87±0.086.75±0.650.93±0.08CC18.19±0.108.54±0.4451.23±4.51 aA2.39±0.0289.27±1.60 abAC28.07±0.135.58±0.131.25±0.22C38.10±0.154.15±0.160.26±0.04DD18.53±0.078.69±0.1856.11±1.77 aA2.38±0.0592.54±1.85 aAD28.82±0.055.41±0.261.13±0.07D38.54±0.053.81±0.150.18±0.04EE19.95±0.058.49±0.1638.00±3.42 bB2.37±0.0588.33±0.85 abAE29.99±0.016.67±0.091.36±0.11E39.89±0.065.26±0.250.28±0.02FF19.90±0.088.57±0.0535.54±1.18 bB2.38±0.0387.92±2.88 bAF29.91±0.026.49±0.141.49±0.12F39.98±0.055.53±0.130.29±0.07

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后無相同大小寫字母分別代表差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。

B～F處理組中TP的去除效果達(dá)到60%以上，C～F處理組可使TP去除率接近或大于90%，D組TP去除率達(dá)到92.54%，但去除效果與C組、E組和F組間未達(dá)到極顯著差異(P>0.01)，說明在投加金魚藻情況下，曝氣處理有利于TP去除，但受曝氣時(shí)長影響不大。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，金魚藻種植密度大的D組、F組曝氣條件下常造成金魚藻斷裂、死亡現(xiàn)象。因此，綜合考慮金魚藻用量和曝氣條件能耗，本研究中金魚藻種植密度為4.44 g·L-1， 曝氣12 h的C組效果最佳，TN、TP去除率分別為51.23%、89.27%。

2.2 水體微生物高通量測序結(jié)果

在97%的序列相似度水平下，通過對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控和過濾，獲得3 283個(gè)OTU。計(jì)算54個(gè)微生物樣品中各組重復(fù)樣品的平均值繪制稀釋曲線，如圖1所示。各樣品的稀釋曲線逐漸趨于平緩，即再增大測序深度也不會(huì)增加新的OTU，說明該樣品的OTU覆蓋度已達(dá)到飽和，能夠反映出水體微生物群落結(jié)構(gòu)的組成。多數(shù)樣品OTU數(shù)量介于700～1 000，B1、D2、A1和B2的OTU數(shù)量超過1 000。

依據(jù)18個(gè)樣品OTU數(shù)量繪制花瓣圖(圖2)，核心OTU數(shù)量為107個(gè)，占OTU數(shù)量最多的B1樣品的9.40%，占OTU數(shù)量最少的B3樣品的14.84%。A1中特有OTU數(shù)量最多，為192個(gè)，占該樣品OTU總數(shù)的17.89%，特有程度最低的為C1，僅占1.00%。從數(shù)量上看，A組特有OTU數(shù)量較多，說明投加金魚藻和曝氣處理改變了原始微生物群落組成。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve

圖2 OTU數(shù)量花瓣圖Fig.2 Petal diagram of OTU number

2.3 微生物群落多樣性變化

基于OTU水平，在3次取樣過程中，A組、B組的Chao 1指數(shù)均降低，差異極顯著，即豐富度隨取樣時(shí)間變化而降低(表3)。C組、E組和F組各自的Chao 1指數(shù)差異未達(dá)到極顯著水平(P>0.01)，D組中在第2次取樣時(shí)雖有極顯著

(P<0.01)上升，但在第3次取樣時(shí)又極顯著(P<0.01)下降至與第1次取樣時(shí)無極顯著差異(P>0.01)，說明4個(gè)組各自的豐富度在3次取樣后未產(chǎn)生極顯著(P>0.01)差異。Shannon指數(shù)差異反映群落多樣性的變化，A組、B組、D組和F組在第3次取樣時(shí)均有極顯著(P<0.01)下降，C組中升高后下降，而E組中下降后升高，C、E兩組在第3次取樣時(shí)其多樣性與第1次取樣時(shí)均無極顯著差異(P>0.01)?？傮w上看，3次取樣過程中，各組內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性均未升高。

同一取樣時(shí)間不同組間比較表明，第1次取樣時(shí)，A組和B組的豐富度高于其余4組，其余4組間差異未達(dá)到極顯著水平(P>0.01)；6組的Shannon多樣性指數(shù)差異均達(dá)到極顯著(P<0.01)水平，B組中最高，C組中最低。第2次取樣時(shí)，C組和D組豐富度接近A組和B組，且C組與E組、F組差異不顯著(P>0.05)；A組和B組、C組和F組Shannon多樣性差異不顯著(P>0.05)，與D組、E組差異極顯著(P<0.01)。第3次取樣時(shí)，除B組豐富度極顯著(P<0.01)低于C組外，其余組間差異均未達(dá)到極顯著水平(P>0.01)；A組多樣性指數(shù)最高，其次為E組，C組和F組多樣性差異仍不顯著(P>0.05)，與B組差異極顯著(P<0.01)，而C、F、B組與D組多樣性差異均不顯著(P>0.05)?？傮w上看，不同處理?xiàng)l件下，隨取樣次數(shù)變化，各組間微生物群落的豐富度與多樣性差異顯著性逐漸降低。

表3 水體微生物群落豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)(OTU水平)

Table 3 Aquatic microbial community richness index and diversity index (OTU level)

處理Treatment樣品SampleChao 1豐富度指數(shù)Chao 1 richness indexShannon多樣性指數(shù)Shannon diversity indexAA1aA1478.25±39.68aAaA4.449±0.024bBA2aA1422.07±79.89abABbB4.369±0.011aAA3bB1187.25±36.28aABcC4.261±0.012aABB1aA1560.87±40.68aAaA4.554±0.004aAB2aA1488.50±19.81aAbB4.392±0.006aAB3bB1074.45±52.20bBcC3.558±0.013dDCC1aA1199.57±41.71bcBcB3.626±0.003fFC2aA1321.39±73.66bcABCaA3.843±0.131cCC3aA1246.86±74.58aAbB3.664±0.031cCDD1bB1081.96±63.77cBaA4.010±0.044dDD2aA1474.70±61.50aAaA4.067±0.036bBD3bB1176.98±93.47abABbB3.605±0.022cdCDEE1bA1090.28±45.01cBaA3.703±0.051eEE2aA1279.51±83.73cBCbB3.522±0.041dDE3aA1237.20±49.65aABaA3.794±0.047bBFF1aA1215.54±119.61bBaA4.253±0.017cCF2aA1215.06±45.07cCbB3.866±0.026cCF3aA1213.25±29.42aABcC3.661±0.056cC

指數(shù)前的字母為同組不同取樣時(shí)間的差異顯著性，指數(shù)后字母為同一取樣時(shí)間不同處理間的差異顯著性。

The letters in front of the index were the difference significance of different sampling time in the same group， and the letters at the back of the index were the difference significance between different groups in the same sampling time.

2.4 水體微生物群落樣品間關(guān)系

在OTU水平上，對(duì)水體微生物樣品做PCA(圖3)，前2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為40.4%。在第一主成分軸上，A1、A2、A3與其余樣品分開，說明A組樣品OTU種類與其余5組存在差異，即投加金魚藻使微生物種類發(fā)生變化。B2、B3與其余樣品同樣具有差異，而C組、D組、E組、F組相距較近，說明投加金魚藻后曝氣處理同樣會(huì)影響微生物的群落組成。在第二主成分軸上，按照3次取樣時(shí)間，大致可將水體樣品分為3組，即隨著取樣時(shí)間變化，微生物種類發(fā)生了變化。總體上看，第一主成分反映出實(shí)驗(yàn)處理組間微生物群落差異，即投加金魚藻和曝氣處理，而第二主成分反映了不同取樣時(shí)間微生物群落之間的差異。

2.5 水體微生物群落結(jié)構(gòu)與變化

2.5.1 門水平群落結(jié)構(gòu)與變化

測序結(jié)果共得到33個(gè)微生物門水平類群(圖4)，優(yōu)勢類群為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，3個(gè)門相對(duì)豐度之和均占各樣品總相對(duì)豐度的70%以上，尤其在E2中高達(dá)84.34%。第1次取樣時(shí)，相較于A組，其余5組中3個(gè)優(yōu)勢類群均具有極顯著(P<0.01)差異，說明投加金魚藻和曝氣處理在短時(shí)間內(nèi)即可改變水體微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖3 基于OTU水平的主成分分析Fig.3 Principal component analysis based on OTU level

變形菌門相對(duì)豐度在E1、E2與C2差異未達(dá)到極顯著水平(0.01

圖4 水體微生物群落門水平相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundances of aquatic microbial communities at phylum level

擬桿菌門相對(duì)豐度在A1、B2、B3中最高，E1、E2、D3(與C3、E3差異不顯著，P>0.05)最低；同組不同取樣時(shí)間，A組、B組、C組和E組在第3次取樣時(shí)相對(duì)豐度有上升趨勢，D組和F組下降，說明投加適量金魚藻有利于提高其相對(duì)豐度，但過量的金魚藻和曝氣處理不利于其繁殖。

放線菌門相對(duì)豐度在A1、E2、F3最高，F(xiàn)1、D2、D3最低；同組不同取樣時(shí)間，6個(gè)組中放線菌門相對(duì)豐度隨取樣時(shí)間均呈上升趨勢，E組和F組中上升幅度非常大，說明投加金魚藻有利于提高其相對(duì)豐度，且該門適于長期曝氣環(huán)境。

此外，浮霉菌門(Planctomycetes)在A組3次取樣中相對(duì)豐度分別為7.86%、10.28%、9.93%，C2(10.28%)、C3(9.21%)、D3(11.03%)中接近10%，裝甲菌門(Armatimonadetes)在C1(8.88%)、E1(8.18%)、F1(6.40%)、F2(8.98%)中比例高于A組、B組(均小于0.2%)；其余微生物類群相對(duì)豐度均小于5%，其中，迷蹤菌門(Elusimicrobia)、Cloacimonetes、Microgenomates及古細(xì)菌Woesearchaeota、Pacearchaeota、廣古菌門(Euryarchaeota)存在于A、B組，其余組內(nèi)比例極低或無，說明曝氣條件改變了原始水體環(huán)境，不利于其繁殖。

2.5.2 屬水平群落結(jié)構(gòu)及變化

屬水平共得到427個(gè)類群，其中變形菌門168屬，接近總屬數(shù)的40%，厚壁菌門73屬、擬桿菌門55屬、放線菌門39屬。如圖5所示，前20個(gè)屬水平類群(相對(duì)豐度之和占77%以上)均為細(xì)菌類群(及藻類)，無古細(xì)菌，除No_Rank、硅藻門(Bacillariophyta)和隱鞭藻科(Cryptomonadaceae)之外的17屬，包括變形菌門9屬(包括Unassigned)、擬桿菌門4屬、放線菌門2屬，浮霉菌門和裝甲菌門各1屬；但無厚壁菌門，說明該門下屬的相對(duì)豐度低。

相對(duì)豐度較高的Unassigned、多核桿菌屬(Polynucleobacter)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)均隸屬于變形菌門，Unassigned隸屬于草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)。在同組的不同取樣時(shí)間，相比于第1次取樣，第3次取樣時(shí)只有C組、E組中其相對(duì)豐度上升，其余4組中均極顯著(P<0.01)降低。在不同組間，A組中其相對(duì)豐度在3次取樣時(shí)均為最高(P<0.01)，分別達(dá)到35.96%、24.27%、26.09%，說明投加金魚藻和曝氣處理不利于其繁殖。

多核桿菌屬在同組不同取樣時(shí)間，A組、F組中相對(duì)豐度極顯著(P<0.01)升高，其余4組中均極顯著(P<0.01)降低；在同一取樣時(shí)間不同組間，E1(30.26%)、E2(20.81%)、F3(21.07%)最高，而A1(2.02%)、A2(4.89%)、C3(3.35%)最低，說明投加金魚藻有利于提高多核桿菌屬相對(duì)豐度，且適于持續(xù)曝氣處理。

圖5 水體微生物群落屬(前20)水平相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundances of aquatic microbial communities at genus level (top 20)

其余屬僅在個(gè)別樣品中占有一定比例，而在其余樣品中相對(duì)豐度較低，如變形菌門的新鞘氨醇桿菌屬(C2中相對(duì)豐度為21.98%)、Limnohabitans(C3中相對(duì)豐度為22.75%)、裝甲菌門的Armatimonas/Armatimonadetes_gp1(F2中相對(duì)豐度為8.98%)、浮霉菌門的小梨形菌屬(Pirellula) (D3中相對(duì)豐度為10.38%)、放線菌門的Rhodoluna(D2中相對(duì)豐度為6.56%)等。

2.6 理化因子對(duì)微生物群落的影響

2.6.1 理化因子對(duì)微生物門水平群落的影響

根據(jù)微生物樣品門水平類群的相對(duì)豐度矩陣做DCA，結(jié)果顯示，梯度長度在第一軸上的值為0.920，選擇RDA研究其相關(guān)性。如圖6所示，第一、二排序軸分別解釋總變量的24.6%、9.6%，多數(shù)類群與第一排序軸成正相關(guān)，與第二排序軸成負(fù)相關(guān)。變形菌門、放線菌門與第一排序軸成負(fù)相關(guān)，擬桿菌門與第一排序軸成正相關(guān)，但其貢獻(xiàn)率較小。變形菌門與放線菌門、擬桿菌門均成負(fù)相關(guān)，后兩者成正相關(guān)，但相關(guān)性較小。

圖中4個(gè)字母為圖4中門拉丁名縮寫。D代表金魚藻種植密度。The four letters in figure were short for the phylum Latin names in figure 4. D represented the planting density of C. demersum.圖6 水體微生物群落(門水平)與理化因子間冗余分析Fig.6 RDA between aquatic microbial community (phylum level) and physicochemical factors

DO、D對(duì)各門水平群落影響極顯著(P<0.01)，與多數(shù)微生物類群成負(fù)相關(guān)，而TN、TP對(duì)各門水平群落影響未達(dá)到極顯著(0.01

2.6.2 理化因子對(duì)微生物屬水平群落的影響

微生物樣品前20個(gè)屬水平群落，除No_Rank、硅藻門和隱鞭藻科外，對(duì)剩余17個(gè)屬(包括Unassigned)的相對(duì)豐度矩陣做DCA，結(jié)果中梯度長度在第一軸上的值為1.681，同樣選擇RDA。如圖7所示，第一、二排序軸分別解釋總變量的23.2%、15.4%。Unassigned與第一排序軸成正相關(guān)，多核桿菌屬與第一排序軸成負(fù)相關(guān)。DO、D對(duì)17個(gè)屬的影響均達(dá)到極顯著(P<0.01)，與多核桿菌屬成正相關(guān)，且DO與多核桿菌屬相關(guān)性較強(qiáng)，說明投加金魚藻與曝氣處理有利于提高多核桿菌屬的相對(duì)豐度。TN、TP對(duì)17個(gè)屬的影響不顯著(P>0.05)，即與TN、TP濃度變化所產(chǎn)生的影響相比，投加金魚藻和曝氣處理對(duì)微生物優(yōu)勢屬相對(duì)豐度的影響更大。

圖中4個(gè)字母為圖5中屬拉丁名縮寫。其中Lims為Limnohabitans的縮寫，Limr為Limnobacter的縮寫。The four letters in figure were short for the genus Latin names in figure 5. Lims was short for Limnohabitans and Limr was short for Limnobacter.圖7 水體微生物群落(屬水平)與理化因子間冗余分析Fig.7 RDA between aquatic microbial community (genus level) and physicochemical factors

3 結(jié)論與討論

本研究表明：沉水植物金魚藻在曝氣條件下對(duì)寒區(qū)靜水濕地水體具有較好的凈化作用，在實(shí)驗(yàn)室固定容器內(nèi)，投加金魚藻并進(jìn)行曝氣處理可有效去除水體TN、TP；水體微生物優(yōu)勢類群為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，屬水平存在較大比例的未分類類群，投加金魚藻和曝氣處理改變了微生物優(yōu)勢門、屬的相對(duì)豐度，各組內(nèi)微生物群落多樣性隨取樣時(shí)間均未升高，且組間差異顯著性逐漸降低；金魚藻種植密度和DO含量對(duì)水體微生物群落有極顯著影響，對(duì)微生物群落起到定向馴化的作用。

3.1 水體凈化效果

本研究利用寒區(qū)靜水濕地常見沉水植物金魚藻，通過曝氣處理增加水體DO含量，達(dá)到TN、TP去除效果。多種水生植物具有凈化水體的作用，如伊樂藻(Elodeanuttallii)[10]、美人蕉(CannaindicaL.)[29]、黃花鳶尾(IriswilsoniiC. H. Wright)[30]等，但這些植物不適合在黑龍江省寒區(qū)濕地環(huán)境中生長。而篦齒眼子菜(PotamogetonpectinatusL.)、蘆葦[Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.][31]、香蒲(TyphaorientalisPresl.)、浮萍(LemnaminorL.)[32]、金魚藻等同樣具有去除水體污染物的功能，而且在黑龍江省自然分布[33]。其中，金魚藻在靜水中懸浮生長，對(duì)污染水體中N、P均具有較好的去除作用[3-6]。本實(shí)驗(yàn)投加金魚藻在曝氣條件下可以達(dá)到TN、TP去除效果。

張萌等[34]研究表明，金魚藻的種植密度為4.0 g·L-1時(shí)，對(duì)TN、TP去除率高達(dá)86.78%、91.82%，最優(yōu)種植密度為4.5～5.0 g·L-1。本研究中金魚藻種植密度分別為4.44 g·L-1和8.89 g·L-1，但在相同曝氣條件下，2種種植密度對(duì)TN、TP去除率差異并不顯著，可能是在固定容器中，金魚藻種植密度在4.44 g·L-1左右已經(jīng)達(dá)到“飽和”。此外，金魚藻種植密度過大常會(huì)造成金魚藻生長不良，植株枯萎。

微生物亦可參與水體生態(tài)修復(fù)[23，35-36]，通過參與固氮、脫氮、硫酸鹽還原、產(chǎn)甲烷過程、金屬離子還原等過程，去除水體污染物[17-18，37-38]。如變形菌門中的氨化細(xì)菌、氨氧化細(xì)菌、亞硝酸鹽氧化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌和浮霉菌門等參與氮循環(huán)[9，39-40]。微生物與植物聯(lián)合可達(dá)到較強(qiáng)的凈化能力，但兩者聯(lián)合對(duì)水體凈化的機(jī)制尚不清晰[15，41]，可能是因?yàn)榕c植物關(guān)聯(lián)的細(xì)菌大多具有降解作用從而增加植物凈化水體的能力[42]。微生物可將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨氮，在有氧條件下轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，氨氮和硝態(tài)氮均可被植物吸收利用[43]。如在本研究對(duì)照組中TN去除率僅為3.21%，且前期相同環(huán)境下單獨(dú)間歇曝氣處理TN去除率與之差異不顯著，投加金魚藻在未曝氣條件下為21.09%，投加金魚藻在曝氣條件下顯著提高了TN去除率。一方面植物光合作用和曝氣可為微生物硝化過程中提供所需的氧氣，另一方面植物吸收微生物轉(zhuǎn)化的氨氮和硝態(tài)氮以去除TN，在一定程度上說明兩者聯(lián)合可有效提高水體凈化能力。

3.2 微生物群落變化及其影響因素

水體微生物群落中變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門常占有絕對(duì)優(yōu)勢[7-11]。本研究結(jié)果同樣表明，寒區(qū)濕地水體樣品不同處理間變形菌門、擬桿菌門、放線菌門相對(duì)豐度較高。變形菌門適應(yīng)能力強(qiáng)，在不同生境中廣泛分布，在水體脫氮除磷過程中起重要作用[44]。本研究中Unassigned、多核桿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬等優(yōu)勢屬均隸屬于變形菌門，且2個(gè)屬常見于水體環(huán)境中[45-46]。

微生物生長、繁殖受植物種類與形態(tài)、pH、DO含量和溫度等因素的影響[14-15，19-21，24]。本研究因在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，水體溫度較為穩(wěn)定，且實(shí)驗(yàn)期間加入蒸餾水以保持水量恒定，pH較小的變化對(duì)微生物群落中優(yōu)勢類群的影響程度均不大。PCA結(jié)果表明，微生物群落變化與不同處理?xiàng)l件、不同的取樣時(shí)間相關(guān)，RDA進(jìn)一步證明理化因子中影響較大的因素為金魚藻種植密度和DO含量。DO含量是對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響最顯著的環(huán)境因子[16]。敬雙怡等[11]研究表明，變形菌門、擬桿菌門與DO含量成正相關(guān)，放線菌門與DO含量成負(fù)相關(guān)。但本研究中變形菌門、放線菌門與DO含量成正相關(guān)，而擬桿菌門與DO含量成負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)樘幚項(xiàng)l件或門下所包含種類不同而產(chǎn)生的不同結(jié)果。Gagnon等[15]認(rèn)為，不同濕地植物可構(gòu)建不同的微生物群落形成“生物膜”，植物根、莖形態(tài)可能是影響“生物膜”中微生物群落多樣性和活性的關(guān)鍵因素。金魚藻為無根沉水植物，在其水體凈化體系中，種植密度影響莖、葉的表面積，以及光合作用與呼吸作用效率，即影響微生物的附著面積和DO含量，進(jìn)而影響微生物群落。因此，在本研究中金魚藻種植密度和DO含量是影響微生物群落變化的直接因素，而TN、TP濃度變化主要依賴于金魚藻與微生物共同作用，是影響微生物群落變化的間接因素。

沉水植物可以影響微生物的群落結(jié)構(gòu)，顯著提高水體中細(xì)菌的多樣性[1]。DO可激活微生物的生物活性，同時(shí)也為微生物提供良好的生長環(huán)境[47]。本研究結(jié)果表明，投加金魚藻和曝氣處理使微生物特有種類減少，各組多樣性指數(shù)均未升高，組間多樣性差異降低，在3次取樣后相對(duì)豐度較高的變形菌門(與擬桿菌門、放線菌門成負(fù)相關(guān)性)和屬水平的Unassigned總體上均呈下降趨勢，說明微生物群落通過改變原優(yōu)勢類群以逐漸適應(yīng)不同處理?xiàng)l件，即投加金魚藻和曝氣處理使微生物群落得以定向馴化。