石亞男,唐 軍,李軍麗,王 杰,占玲俊

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所；衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動物模型工程技術(shù)研究中心；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院結(jié)核病中心,北京 100021)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(簡稱結(jié)核菌,Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的慢性傳染性疾病,是全球十大死因之一。 2019 年世界衛(wèi)生組織(WHO)報告指出,2017 年全球結(jié)核病人數(shù)約為17 億,其中新發(fā)結(jié)核病例1010 萬人,結(jié)核病死亡人數(shù)約為157 萬[1],WHO 呼吁2030 年終止結(jié)核,因此結(jié)核的防控研究尤為任重而急迫。

程序性死亡配體1(PD-L1)高表達(dá)與活動性結(jié)核緊密相關(guān),PD-L1 表達(dá)于多種免疫細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞[2]。 其中巨噬細(xì)胞是結(jié)核病肉芽腫形成的主要細(xì)胞[3],巨噬細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞,在感染過程中通過吞噬殺傷、抗原提呈和分泌多種細(xì)胞因子等功能來調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[4],是宿主控制Mtb 感染擴(kuò)散的重要防御屏障。 體外Pdl1 敲低實(shí)驗(yàn)表明,PD-L1 可以通過PD-1: PD-L1/PD-L2 通路在結(jié)核感染中發(fā)揮免疫抑制作用[5-7],而體內(nèi)作用機(jī)制不明,且體外作用的具體分子機(jī)制不明。 除了PD1:PD-L1 通路外,結(jié)核病中PD-L1 是否存在類似其他感染或腫瘤疾病中的其它配體和通路,目前還未見報道,其分子機(jī)制需要深入研究。

我們通過Cre-loxp 技術(shù)構(gòu)建巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠[8],主要目的是在結(jié)核感染中,動物體內(nèi)研究PD-L1 對巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制。 本研究通過比較不同敲除水平Pdl1 的巨噬細(xì)胞感染Mtb后轉(zhuǎn)錄譜變化,從生物信息學(xué)篩選到的差異表達(dá)基因角度,分析結(jié)核菌感染中PD-L1 發(fā)揮作用的分子機(jī)制,為深入研究PD-L1 在結(jié)核感染發(fā)病中免疫作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(菌號為93009)為本室保存,使用前活化并將菌懸液濃度調(diào)整為1.0×107CFU/mL,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

3 只4 ～6 周齡SPF 級雄性Pdl1Flox/-小鼠體重12～14 g,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所基因工程平臺采用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建。 4 ～6周齡SPF 級野生型C57BL/6 小鼠購自北京維通利華[SCXK(京)2017-001],體重12 ～14 g,4 ～6 周齡SPF 級雄性Lyz2-iCre 小鼠由南京大學(xué)模式動物中心惠贈,體重12 ～14 g,均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所屏障環(huán)境動物房[SYXK(京)2014-0029],動物實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到本所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會(IACUC)的批準(zhǔn),批準(zhǔn)號為ZLJ19003,所有動物按3R 原則予以關(guān)懷。

1.2 主要試劑

中性羅氏培養(yǎng)管(珠海貝索生物,中國)；FBS、DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基(Gibco,美國)；TRIzol Reagent(Life Technologies,美國)；DNA 提取試劑盒(EE101-02)購自北京全式金；PCR 引物由上海英濰捷基合成；1×RBC Lysis Buffer、Anti-mouse CD3e FITC(eBioscience,美國)；PE/Cy7 anti-mouse CD19、APC anti-mouse CD4、FITC anti-mouse/human CD11b、APC anti-mouse F4/80、PE anti-mouse CD274(B7-H1,PD-L1)(Biolegend,美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠制備和繁育

巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠的設(shè)計(jì)利用了位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)Cre/loxp 原理,需要在Pdl1基因序列的兩端各放置一個loxp 序列,得到Pdl1Flox/-小鼠。 將Pdl1Flox/-小鼠與巨噬細(xì)胞特異的Cre 小鼠交配繁殖,以獲得在巨噬細(xì)胞內(nèi)把Pdl1 基因敲除掉的小鼠,即巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠,具體方法如下:

Pdl1Flox/-小鼠構(gòu)建成功后,與C57BL/6 小鼠進(jìn)行雜交,得到的Pdl1Flox/-小鼠進(jìn)行自交,進(jìn)一步得到Pdl1Flox/Flox小鼠,將雌性Pdl1Flox/Flox小鼠和帶有巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)Cre 酶的Lyz2-iCre 雄鼠進(jìn)行雜交,得到Pdl1Flox/--Cre 小鼠,最后將Pdl1Flox/Flox小鼠和Pdl1Flox/-- Cre 小 鼠 雜 交, 最 終 得 到 1/4 的Pdl1Flox/Flox- Cre 小鼠,即為巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠,同時獲得1/4 的Pdl1Flox/--Cre 小鼠及1/2的同窩陰性Pdl1Flox/Flox小鼠。

1.3.2 小鼠基因型鑒定

剪腳趾標(biāo)記出生幼鼠,收集腳趾并進(jìn)行全基因組DNA 提取。 每管加入100 μL LB2 和20 μL 蛋白酶K,56℃金屬浴孵育至完全裂解后參照DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行,純化后的全基因組DNA 儲存于-20℃冰箱備用。 根據(jù)待鑒定樣品數(shù)量配制所需的PCR 反應(yīng)體系,同時設(shè)置陰性對照和陽性對照進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 其中Pdl1-loxp 上游引物序列為: 5’TGTAAACTATTAGACTGGCTGGAATGTAG 3’；下游引 物 序 列 為: 5’ GATGCAAGCTAGATAATATATT CCCAGTC 3’,目標(biāo)片段大小為KI 1700 bp。 Cre 上游引物序列為:5’AGTGCTGAAGTCCATAGATCGG 3’；下游引物序列為5’CTGATTCTCCTCATCACC AGG 3’。 目標(biāo)片段大小為543 bp。 待擴(kuò)增完畢,分別進(jìn)行2%和1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 PD-L1 表達(dá)水平的檢測

(1) 腹腔巨噬細(xì)胞PD-L1 表達(dá)水平檢測:Pdl1Flox/Flox- Cre、Pdl1Flox/-- Cre、Pdl1Flox/Flox小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉肉湯1 mL,3 d 后小鼠斷頸處死,無菌分離腹腔巨噬細(xì)胞；1300 r/min、室溫離心10 min,RPMI-1640 培養(yǎng)基洗滌巨噬細(xì)胞兩次,1 mL PBS 重懸細(xì)胞,分別加入APC-F4/80、FITCCD11b 和PE-CD274 流式抗體,以同型對照PE-IgG為陰性對照,室溫避光孵育15 min,1500 r/min,離心5 min,棄上清；2 mL PBS 洗滌細(xì)胞,1 mL PBS 重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析以檢測巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平。

(2)T 細(xì)胞與B 細(xì)胞PD-L1 表達(dá)水平檢測:無菌解剖Pdl1Flox/Flox- Cre、Pdl1Flox/-- Cre、Pdl1Flox/Flox小鼠,脾研磨液過70 μm 孔徑篩網(wǎng),1500 r/min,離心5 min,棄上清；每管加入5 mL 1×RBC Lysis Buffer,渦旋30 s,室溫靜置4 min；1500 r/min,4℃,離心5 min,棄上清,5 mL PBS 洗滌細(xì)胞3 次,1 mL PBS 重懸細(xì)胞,分別加入FITC-CD3e、APC-CD4、PE/Cy7-CD19 和PE-CD274 流式抗體,以同型對照PE-IgG為陰性對照,室溫避光孵育15 min,同上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析以檢測T 細(xì)胞與B 細(xì)胞PD-L1 表達(dá)水平。

1.3.4 感染與檢測

取24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入500 μL 新分離的Pdl1Flox/Flox- Cre、Pdl1Flox/-- Cre、Pdl1Flox/Flox小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,濃度為1×106細(xì)胞/mL。 37℃、5%CO2貼壁培養(yǎng)2 d；棄上清,每孔補(bǔ)加500 μL DMEM完全培養(yǎng)基,按MOI 10 加入Mtb 進(jìn)行感染,未感染對照組每孔加入等體積的DMEM 完全培養(yǎng)基；感染24 h 后,棄上清,1 mL PBS 洗滌貼壁細(xì)胞3 次,每孔加入1 mL TRIzol 并收集各組細(xì)胞裂解液,提取全基因組進(jìn)行測序和數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

基因組比對采用STAR(v2.5.2b)軟件,差異表達(dá)分析采用DEGSeq(v1.12.0)軟件,基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析采用GOSeq 軟件(v1.22),京都基因和KEGG 富集分析采用KOBAS(v2.0)軟件。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠基因鑒定

繁育實(shí)驗(yàn)所需巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠,剪新出生小鼠腳趾,提取鼠趾基因組,用PCR 技術(shù)進(jìn)行小鼠基因鑒定。 Pdl1Flox/Flox-Cre 小鼠(圖中標(biāo)號為7、10 小鼠)及Pdl1Flox/--Cre 小鼠(圖中標(biāo)號為3、4、6、8、12 小 鼠) 用 于 進(jìn) 一 步 研 究,同 窩 陰 性Pdl1Flox/Flox小鼠(圖中標(biāo)號為9 小鼠)作為對照組,圖中標(biāo)號1、11 為野生型小鼠,2、5 為Pdl1Flox/-小鼠(圖1)。

2.2 PD-L1 表達(dá)的檢測結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn):Pdl1Flox/Flox- Cre 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PD-L1 的表達(dá)量是顯著偏低的,P ＜0.001(圖2A - 1)；三種亞品系Pdl1Flox/Flox-Cre、Pdl1Flox/--Cre、Pdl1Flox/Flox小鼠T 細(xì)胞與B 細(xì)胞PDL1 的表達(dá)量是大致相同的(圖2B-1 與圖2C-1)。因此巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠制備成功。

2.3 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量

測序后Pdl1Flox/Flox- Cre 感染組、Pdl1Flox/-- Cre感染組、Pdl1Flox/Flox感染組及其各自對應(yīng)的未感染組數(shù)據(jù)質(zhì)量通過過濾后的測序數(shù)據(jù)(Clean reads)大小、99.00%堿基正確識別率(Q20)和99.90%堿基正確識別率(Q30)來判定(表1)。 可見,測序質(zhì)量能夠滿足后續(xù)分析的要求。

2.4 測序序列(reads)與參考基因組比對結(jié)果

各組樣品reads 與參考基因組比對的總百分比(Total mapped reads): Pdl1Flox/Flox-Cre 感染組為98.66%,Pdl1Flox/--Cre 感染組為98.70%,Pdl1Flox/Flox感染組為98.57%, 未感染組分別為98.67%,98.69%和98.58%,均高于65.00%,表明參考基因組選擇合適(表2)。

2.5 差異表達(dá)分析結(jié)果

差異表達(dá)結(jié)果的分析比較思路是:將每個亞品系的小鼠的感染組與未感染組相比,其差異基因認(rèn)為是與Mtb 感染相關(guān)的候選基因,然后將每個敲除小鼠篩到的與Mtb 感染相關(guān)的候選基因與同窩陰性小鼠分別比較,其差異基因再結(jié)合Pdl1Flox/Flox-Cre 和Pdl1Flox/--Cre 小鼠共同的Mtb 感染相關(guān)基因分析,最終得到結(jié)核感染中PD-L1 特異性的基因。

與Pdl1Flox/Flox-Cre 的未感染組相比,Pdl1Flox/Flox-Cre 感染組差異表達(dá)的基因共有744 個(Q ＜0.005),其中上調(diào)表達(dá)基因415 個,下調(diào)表達(dá)基因329 個(圖3A)；與Pdl1Flox/--Cre 的未感染組比較,Pdl1Flox/--Cre 感染組差異表達(dá)的基因共有811 個(Q ＜0. 005),其中上調(diào)表達(dá)基因459個,下調(diào)表達(dá)基因352 個(圖3B)；與Pdl1Flox/Flox的未感染組比較,Pdl1Flox/Flox感染組差異表達(dá)的基因共有510 個(Q＜0.005),其中上調(diào)表達(dá)基因332 個,下調(diào)表達(dá)基因178 個(圖3C)。

圖1 巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠基因鑒定Note. N, Negative control. P, Positive control. M, DNA marker.Figure 1 Genotype identification of macrophage-specific Pdl1 conditional knockout mice

表1 感染組和未感染組數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量Table 1 Data output quality list in infected group and uninfected group

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞、T、B 細(xì)胞上PD-L1 的表達(dá)Note. A, The above stands for the negative control of macrophages, and the below is the expression of PD-L1 in peritoneal macrophages of three sub-lineage mice. B, The above stands for the negative control of B cells, and the below is the expression of PD-L1 in B cells of three sub-lineage mice. C,The above stands for the negative control of T cells, and the below is the expression of PD-L1 in T cells of three sub-lineage mice. The blue peak represents Pdl1Flox/-with Cre mice, the red peak indicates Pdl1Flox/Floxwith Cre mice, and the green peak represents Pdl1Flox/Flox mice. Compared with the Pdl1Flox/Flox group,***P ＜0.001.Figure 2 The expression levels of PD-L1 on macrophages, T cells,and B cells were detected by flow cytometry

2.6 差異表達(dá)基因的GO 富集分析結(jié)果

與未感染組相比,Pdl1Flox/Flox-Cre 感染組,Pdl1Flox/--Cre 感染組,Pdl1Flox/Flox感染組最顯著富集組份均為參與免疫反應(yīng)的GO:0006955 (P ＜0. 01)與參與免疫系統(tǒng)過程的GO:0002376(P ＜0. 01),涉及差異表達(dá)的基因分別為18 個(表3),28 個(表4),20 個(表5),其中Pdl1Flox/Flox-Cre 感染組與Pdl1Flox/--Cre 感染組共有32 個差異表達(dá)基因,其中30 個基因表達(dá)上調(diào),2 個基因表達(dá)下調(diào)。 這些共有的差異表達(dá)基因進(jìn)一步與Pdl1Flox/Flox感染組進(jìn)行比較,剔除相同基因,篩選出的候選基因初步定為結(jié)核感染中PD-L1 相關(guān)的特異基因,共17 個基因,其中13 個基因表達(dá)上調(diào),4 個基因表達(dá)下調(diào)。

表2 感染組和未感染組reads 與參考基因組比對情況Table 2 Comparison of reads and reference genomes between infected group and uninfected group

圖3 差異基因火山圖Note, A, The Pdl1Flox/Flox with Cre infected group compared with the uninfected group. B, The Pdl1Flox/- with Cre infected group compared with the uninfected group. C, The Pdl1Flox/Floxinfected group compared with the uninfected group. The abscissa represents the fold change in gene expression in different samples,and the ordinate represents the statistically significant differences in gene expression.The significantly differentially expressed genes are represented by red dots (upregulation) and green dots (downregulation). Genes that were not significantly differentially expressed are indicated by blue dots.Figure 3 Differential gene volcano map

表3 PD-L1Flox/Flox-Cre 感染組與其未感染組相比差異表達(dá)基因GO 最顯著富集分析的前2 項(xiàng)Table 3 Most two enriched terms of GO enrichment analysis of differentially expressed genes in PD-L1Flox/Flox-Cre infected group compared with its uninfected group

表4 PD-L1Flox/--Cre 感染組與其未感染組相比差異表達(dá)基因GO 最顯著富集分析的前2 項(xiàng)Table 4 Most two enriched terms of GO enrichment analysis of differentially expressed genes in PD-L1Flox/--Cre infected group compared with its uninfected group

上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因名稱及對應(yīng)的變化倍數(shù)對數(shù)值[|log2(FoldChange)|]整理如下:上調(diào)表達(dá)的基因包括促炎因子趨化因子配體2(Ccl2,3.4677)、趨化因子配體7(Ccl7,8.1765)、白介素12a(Il12a,6.1789)、白介素6(Il6,9.0296)、趨化因子(C-X-C 模體)配體1(Cxcl1,6.1104)、趨化因子(C-X-C 模體)配體9(Cxcl9,1.9734)、組織相容性2,Q 區(qū)基因座5(Qa5,1.3648)、組織相容性2,M 區(qū)基因座2(Hmt,1.2766)、組織相容性2,T 區(qū)基因座23(Qa1, 1.1328)、 鳥苷酸結(jié)合蛋白4 (Gbp4,4.6111)、鳥苷酸結(jié)合蛋白8(Gbp8,2.8399)、鳥苷酸結(jié)合蛋白9(Gbp9,4.9383)、鳥苷酸結(jié)合蛋白11(Gbp11,6.649)。 下調(diào)表達(dá)的基因包括趨化因子(C-C 模體)配體9(Ccl9,1.3723)、白介素1 受體拮抗劑(Il1rn,1.9407)、補(bǔ)體成分1q 亞成分,α 多肽(C1qa,1.392) 和組織相容性2,K 區(qū)基因座2(H2k2,1.2708)。 上述基因表明Mtb 感染Pdl1 敲除的巨噬細(xì)胞24 h 后,可能通過上述免疫分子參與結(jié)核的特異性免疫反應(yīng)。

2.7 差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析結(jié)果

通過京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,發(fā)現(xiàn)與未感染組相比,Pdl1Flox/Flox-Cre 感染組最顯著富集的通路為Toll 樣受體(Toll-like receptors)信號通路、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NFκB)信號通路及缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路(P＜0.01,表6)；Pdl1Flox/--Cre 感染組最顯著富集的通路為腫瘤壞死因子(TNF)信號通路及NF-κB 信號通路(P＜0.01,表7)；Pdl1Flox/Flox感染組最顯著富集的通路為TNF 信號通路及NF-κB 信號通路(P＜0.01, 表 8)。 其 中 Pdl1Flox/Flox-Cre 感 染 組 與Pdl1Flox/--Cre 感染組富集的通路中共有16 個差異表達(dá)基因,表達(dá)均上調(diào),這些共有的差異表達(dá)基因進(jìn)一步與Pdl1Flox/Flox感染組進(jìn)行比較,剔除相同基因,篩選出6 個基因,表達(dá)均上調(diào),基因名稱及變化倍數(shù)對數(shù)值[| log2(FoldChange)|]整理如下:CD40 抗原(Cd40,3.9838)、TNF 受體相關(guān)因子1(Traf1,2.2187)、 TNF 受體相關(guān)因子2 (Traf2,1.3572)、TNF 受體相關(guān)因子3(Traf3,1.3196)、前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2(Ptgs2,7.7714)、Caspase募集結(jié)構(gòu)域11(Card11,3.3684),上述基因初步定為結(jié)核感染中PD-L1 相關(guān)的特異基因。

表6 PD-L1Flox/Flox-Cre 感染組與其未感染組相比差異表達(dá)基因KEGG 最顯著富集分析Table 6 Most enriched pathway terms of KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in PD-L1Flox/Flox-Cre infected group compared with its uninfected group

表7 PD-L1Flox/--Cre 感染組與其未感染組相比差異表達(dá)基因KEGG 最顯著富集分析Table 7 Most enriched pathway terms of KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in PD-L1Flox/--Cre infected group compared with its uninfected group

表8 PD-L1Flox/Flox感染組與其未感染組相比差異表達(dá)基因KEGG 最顯著富集分析Table 8 Most enriched pathway terms of KEGG enrichment analysis of differentially expressed genesin PD-L1Flox/Flox infected group compared with its uninfected group

3 討論

巨噬細(xì)胞在宿主抗結(jié)核分枝桿菌的感染免疫中起關(guān)鍵作用[9],Mtb 通過抑制吞噬體成熟、抑制吞噬體和溶酶體融合、抑制巨噬細(xì)胞凋亡、干擾抗原呈遞、抑制自噬等,逃逸巨噬細(xì)胞對Mtb 的殺傷[10],但其具體機(jī)制和過程尚未闡明。 研究發(fā)現(xiàn)在活動性結(jié)核病人中,PD-L1 在中性粒細(xì)胞(PMN)和單核/巨噬細(xì)胞(Mo/MΦ)表達(dá)升高最顯著,PD-L1 表達(dá)下降與活動性結(jié)核的好轉(zhuǎn)有密切關(guān)系[11],體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):PD-1/PD-L1 通路阻斷后,巨噬細(xì)胞對Mtb的吞噬和胞內(nèi)殺傷活性明顯增強(qiáng)[12],然而具體分子機(jī)制不明。 此外,PD-L1 是否有其他受體配體通路,目前尚未證實(shí),因此探討PD-L1 在Mtb 感染的巨噬細(xì)胞中的作用對結(jié)核防治的基礎(chǔ)研究有重要意義。

本研究通過Cre-loxp 技術(shù)構(gòu)建巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠模型,通過PCR 和流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)巨噬細(xì)胞特異性Pdl1 敲除小鼠構(gòu)建成功。 分離腹腔巨噬細(xì)胞,對Mtb 感染前后的不同敲除小鼠的巨噬細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq 及生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明:Mtb 感染的Pdl1 敲除巨噬細(xì)胞中基因表達(dá)譜發(fā)生改變,通過GO 和KEGG 富集分析,初步篩選出23個PD-L1 相關(guān)的候選基因,其中某些基因在腫瘤和病毒感染中已有相關(guān)報道,在人卵巢癌和結(jié)腸癌中,阻斷PD-1/PD-L1 信號通路,可促進(jìn)Th1 型趨化因子CXCL9 的分泌[13],促進(jìn)效應(yīng)T 細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞浸潤,增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤微環(huán)境中,CCL2、CXCL1、PTGS2 及CD40 的表達(dá)與PD-L1 的表達(dá)呈正相關(guān)[14-17],阻斷PD-1/PD-L1 信號通路,可促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)釋放促炎細(xì)胞因子IL6,增強(qiáng)Th1 免疫應(yīng)答和抗腫瘤作用[18]。 在人丙型肝炎病毒(HCV)感染中,阻斷PD-1/PD-L1 信號通路,可增強(qiáng)低表達(dá)TRAF1 的特異性CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)[19]。 如前所述,在結(jié)核分枝桿菌感染中,抑制PD-1/PD-L1 信號通路可促進(jìn)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞釋放炎性因子IL6,增強(qiáng)先天免疫反應(yīng)[12]。

通過KEGG 富集分析,發(fā)現(xiàn)與PD-L1 有關(guān)的通路包括Toll 樣受體信號通路、NF-κB 信號通路、HIF-1 信號通路及TNF 信號通路。 在Mtb 感染初期,Toll樣受體作為天然免疫細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)劑發(fā)揮著重要作用,隨后,Toll 樣受體及信號通路對特異性細(xì)胞免疫產(chǎn)生影響。 此外,Toll 樣受體信號通路亦參與調(diào)控結(jié)核菌免疫逃逸的發(fā)生,是導(dǎo)致結(jié)核慢性感染的根源所在[20]。 NF-κB 是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子,其活化可激活下游眾多的細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,NF-κB信號通路和NF-κB 依賴性細(xì)胞因子在遏制結(jié)核菌感染中至關(guān)重要[21]。 HIF-1 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,是由HIF-1α 和HIF-1β 組成的異源二聚體,其中HIF-1α 為主要的調(diào)節(jié)亞基,在缺氧、腫瘤及炎癥情況下可廣泛表達(dá)[22],是抗結(jié)核分枝桿菌感染的重要介質(zhì)[23]。 TNF 信號傳導(dǎo)通路主要包括Caspase 家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、銜接蛋白TRAF 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和JNK 蛋白激酶的活化,在抗結(jié)核感染中發(fā)揮重要作用[24]。

本研究通過GO 富集分析發(fā)現(xiàn)的免疫反應(yīng)有關(guān)的17 個候選基因與KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)的免疫及炎癥相關(guān)代謝通路的6 個候選基因,可能是結(jié)核感染中PD-L1 作用相關(guān)的特異性分子,后期將對這23個基因進(jìn)行細(xì)胞水平和動物體內(nèi)的驗(yàn)證和功能機(jī)制研究,為結(jié)核防治的基礎(chǔ)研究提供線索。