梁 亮,賈蒙綱,金 偉,曹穎穎,唐海波*,冷 靜*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530200； 2.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南寧 530200)

樹鼩(tree shrew,Tupaia belangeri)是樹鼩科樹鼩屬動(dòng)物,為哺乳動(dòng)物,主要生活在熱帶、亞熱帶地區(qū),是一種具有良好潛力的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 樹鼩作為新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在特定藥物研發(fā)中有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì),從解剖學(xué)分析,樹鼩的免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的組織形態(tài)特征與靈長(zhǎng)類有很高的相似度[1]。 樹鼩全基因組與多個(gè)物種基因組比較分析證實(shí)了樹鼩與靈長(zhǎng)類親緣關(guān)系最為接近。 此外樹鼩與人類在生理機(jī)能、生化代謝和基因組等方面的相似性遠(yuǎn)高于大鼠、小鼠、土撥鼠等常用嚙齒類動(dòng)物。 樹鼩的許多分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)近似人類,同時(shí)樹鼩個(gè)體小,易于操作,價(jià)格相對(duì)便宜等優(yōu)點(diǎn),性成熟時(shí)間比較短,飼養(yǎng)方法簡(jiǎn)單且繁殖較快[2]。 因此樹鼩有望代替靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為某些人類重大疾病研究的動(dòng)物模型,具有廣泛的應(yīng)用前景[3-7]。

樹鼩是一種形似松鼠的小型哺乳動(dòng)物,我國(guó)樹鼩分布于中國(guó)南部和西南部,統(tǒng)屬于中緬樹鼩(Tupaia belangeri chioensis),具有6 個(gè)亞種。 滇西亞種(T. b. chinensis),也就是目前我國(guó)研究最廣泛最多的一個(gè)種類,分布于云南西部、中部和南部以及四川西南部。 其他的樹鼩還包括高黎貢山亞種(T.b. gaoligongensis)、海南亞種(T. b. modesta)、越北亞種(T. b.toninia)、滇南亞種(T. b. yunalis)和瑤山亞種(廣西西北部)( T. b. yaoshanensis)[8]。

廣西瑤山亞種樹鼩是廣西的一個(gè)特色的物種資源,具有重要開發(fā)潛力的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,主要分布在廣西金秀等地。 瑤山亞種樹鼩與中緬樹鼩其他亞種的外形有較大的差異,其體型是我國(guó)6 種中緬樹鼩亞種中最大的,成年體重為150～250 g,體長(zhǎng)14.0～19.5 cm。 并且其生物學(xué)特性如乳酸脫氫酶(LDH)同功酶等與其他亞種存在較大的差異[9],在其飼養(yǎng)和繁殖等方面,仍有許多問題未解決,樹鼩對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高,消化道傳染病多,致死率較高,且其繁殖的數(shù)量較低。 關(guān)于廣西瑤山亞種樹鼩的飼養(yǎng)、疾病等的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少,對(duì)野生瑤山亞種樹鼩腸道細(xì)菌的種群分布情況,攜帶致病菌資料處于空白狀態(tài)。 因此我們開展了瑤山亞種樹鼩糞便可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與鑒定,了解野外捕獲的野生瑤山亞種樹鼩糞便菌群的多樣性和潛在的致病性,為瑤山亞種樹鼩的隔離檢疫、實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)及常見消化道疾病的防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生瑤山亞種樹鼩來自廣西金秀瑤族自治縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心用捕鼠籠捕獲的當(dāng)?shù)厣忠吧恢苣曜笥医】惮幧絹喎N樹鼩,公母隨機(jī),毛色光亮,體型勻稱,體重在131～248 g 之間,共19 只成年瑤山亞種樹鼩。 運(yùn)送至廣西中醫(yī)藥大學(xué)人工馴化養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(桂)2019-0001],經(jīng)由廣西倫理審查委員會(huì)審查通過(GXIRB 2018-0006),動(dòng)物使用遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

超凈工作臺(tái)(型號(hào):SW-CJ-2FD)購(gòu)自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱(型號(hào):LRH-150F)購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TIANGEN 細(xì)菌總DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；SS 培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)、瓊脂粉等購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；常用藥敏試紙:慶大霉素(10 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、復(fù)方新諾明(30 μg)頭孢挫林(30 μg)、頭孢西叮(30 μg)、頭孢他啶(30 μg)、紅霉素(15 μg)、青霉素(10 U)、氨芐西林(10 μg)購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司,其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糞便標(biāo)本采集及處理

所有糞便標(biāo)本采集及處理相關(guān)設(shè)施均高壓滅菌處理后,分別用滅菌的鑷子采集19 只新捕獲的野生瑤山亞種樹鼩喂食后4 h 的新鮮糞便,每一只樹鼩的糞便單獨(dú)編號(hào),并分成兩份,一份取豌豆粒大小至10 mL 滅菌的離心管中,加醫(yī)用生理鹽水5 mL,震蕩混勻后再低速離心1 min,取上清,置-80℃或進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),一份直接置-80℃。

1.3.2 細(xì)菌的初步分離

將每份糞便上清分別在麥康凱(MAC)培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)(EMB)培養(yǎng)基上進(jìn)行分區(qū)劃線,置于生化培養(yǎng)箱37℃倒置培養(yǎng)24～48 h。 根據(jù)培養(yǎng)后菌落形態(tài)、顏色及溶血等特性,初步排除鑒定或懷疑為大腸桿菌的菌落,挑取除大腸桿菌外的單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落,并進(jìn)行重復(fù)劃線純化培養(yǎng),直到菌落的形態(tài)特征一致。 并挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及純化,最后接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng),4℃冰箱保存?zhèn)溆没?0%的甘油保存至-80℃。

1.3.3 細(xì)菌的革蘭染色

對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行按照說明書進(jìn)行革蘭染色并在油鏡下進(jìn)行鏡檢,記錄所以菌株革蘭染色結(jié)果和細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.3.4 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

用TIANGEN 細(xì)菌總DNA 提取試劑盒提取分離細(xì)菌的總DNA。 采用16S rRNA 通用引物27F/1429R,以細(xì)菌總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并送上海生物工程有限公司測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果在NCBI 上BLAST 比對(duì),并鑒定細(xì)菌的種類。 將分離致病菌16S rRNA 基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)核酸序列進(jìn)行Blast 比對(duì)分析,并應(yīng)用MEGA 7.0[10]軟件中Maximum likelihood 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.3.5 細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)方法(紙片擴(kuò)散法)

將在試管里培養(yǎng)好的細(xì)菌通過移液槍吸取100 μL 轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,立刻用三角形無菌推棒涂布之后,將藥敏試紙貼于培養(yǎng)基表面并輕輕按壓使之貼緊呈三角形,室溫放置15 min 后入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 分別貼上相應(yīng)的藥敏試紙。 在37℃下培養(yǎng)24 h 后,觀察結(jié)果并測(cè)量抑菌圈大小(mm)。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA 序列分析結(jié)果

圖1 野生瑤山亞種樹鼩糞便分離的細(xì)菌初步排除大腸桿菌后檢出情況Figure 1 Detection of bacteria isolated from the feces of wild T.b. yaoshanensis after Escherichia coli was preliminarily excluded

排除初步鑒定或懷疑為大腸桿菌的菌落,剩下的細(xì)菌經(jīng)過16 s rRNA 序列分析,從19 只樹鼩中分離鑒定得到7 科13 屬20 種共35 株細(xì)菌(見圖1、表1)。 包括腸桿菌科、細(xì)球菌科、氣單胞菌科、球桿菌科、芽孢桿菌科、假單胞菌科、微桿菌科共7 科的相關(guān)細(xì)菌。 檢出率最高的為腸桿菌科細(xì)菌占68.57%,其中大腸埃希氏菌31.58%(6/19)和弗氏檸檬酸桿菌26.32%(5/19)的檢出率最高。 其次為奇異變形桿菌、氣單胞菌屬、松鼠葡萄球菌等；其他檢查的細(xì)菌包括假單胞菌屬、雷氏普羅威登斯菌、氣單胞菌屬、溶血葡萄球菌等。 先前的報(bào)道包括弗氏檸檬酸桿菌[11-12]、奇異變形桿菌[13]、氣單胞菌屬[14]、松鼠葡萄球菌[15]、假單胞菌屬[16]、雷氏普羅威登斯菌[17]等都可能成為條件性致病菌,同時(shí)也可能造成人畜共患性感染。 這些優(yōu)勢(shì)菌種的檢出,這為廣西野生瑤山亞種樹鼩糞便菌群的多樣性和潛在的致病性提供了第一手資料,為瑤山亞種樹鼩的隔離檢疫及實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、常見消化道疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

2.2 瑤山亞種樹鼩糞便分離的細(xì)菌初步排除大腸桿菌后細(xì)菌遺傳進(jìn)化樹

排除初步鑒定或懷疑為大腸桿菌的菌落,剩下的細(xì)菌根據(jù)16S rRNA 測(cè)序結(jié)果,運(yùn)用MEGA 7.0 軟件Maximum likelihood 的方法建立細(xì)菌的種系遺傳進(jìn)化樹,確定35 株細(xì)菌在分子生物學(xué)分類學(xué)的進(jìn)化關(guān)系和親緣關(guān)系(圖2)。 所有的細(xì)菌大體分為7 個(gè)分支,有細(xì)菌的分科大體一致,相關(guān)細(xì)菌或多或少都有一定的親緣關(guān)系,說明物種腸道菌群的分布或許跟該物種進(jìn)化有一定的關(guān)系。

2.3 瑤山亞種樹鼩糞便分離的細(xì)菌常見抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)。

為了了解瑤山亞種樹鼩腸道細(xì)菌對(duì)藥物的敏感與耐藥情況,本研究對(duì)分離得到的部分腸道細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn),常見藥物對(duì)瑤山亞種樹鼩腸道陰性菌敏感多,陽(yáng)性菌耐藥多。 瑤山亞種樹鼩腸道分離細(xì)菌對(duì)頭孢唑啉藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,耐藥率為59%,中介占17%,敏感占24%；頭孢西丁,耐藥率為38%,中介占3%,敏感占59%；頭孢他啶,耐藥占28%,中介占3%,敏感占69%。 紅霉素、氨芐西林及復(fù)方新諾明對(duì)瑤山亞種樹鼩腸道部分分離細(xì)菌的敏感性顯示,耐藥率均大于敏感率；青霉素對(duì)瑤山亞種樹鼩腸道部分分離細(xì)菌的敏感性顯示,耐藥率等于敏感率；慶大霉素及左氧氟沙星對(duì)瑤山亞種樹鼩腸道部分分離細(xì)菌的敏感性顯示,敏感率均大于耐藥率(具體見表2)。今后瑤山亞種樹鼩發(fā)生消化道相關(guān)疾病時(shí),建議可采用如慶大霉素、左氧氟沙星及頭孢他啶類抗生素治療。

表1 瑤山亞種樹鼩糞便分離的細(xì)菌初步排除大腸桿菌后16S rRNA 序列分析結(jié)果Table 1 The results of 16S rRNA sequence analysis of bacteria isolated from the feces of T.b. yaoshanensis after Escherichia coli was preliminarily excluded

3 討論

野生瑤山亞種樹鼩糞便分離的細(xì)菌初步排除大腸桿菌后,細(xì)菌經(jīng)16S rRNA 序列分析,共鑒定出7 科13 屬20 種共35 株可培養(yǎng)細(xì)菌,其中腸桿科7屬24 株細(xì)菌分別為:克呂沃爾氏菌屬,腸桿菌屬、泛菌屬、枸櫞酸桿菌屬、埃希氏菌屬、變形桿菌屬、普羅維登斯菌屬。 據(jù)報(bào)道[18]變形桿菌是引起樹鼩腹瀉和死亡的常見菌。

高家紅等[19]關(guān)于樹鼩正常腸道細(xì)菌的研究顯示,大腸桿菌、葡萄球菌菌群及鏈球菌菌群的檢出率較高,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異。 可能前者其結(jié)果主要是分離鑒定正常腸道細(xì)菌,與本文采用的分離與鑒定的野生的瑤山亞種樹鼩糞便細(xì)菌有一定的差異,此外也可能跟樹鼩的種類、馴化程度、飼料及環(huán)境有關(guān),所以掌握野生瑤山亞種樹鼩腸道細(xì)菌種類及多樣性的情況,為本馴養(yǎng)中心今后相關(guān)疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自于廣西野生瑤山亞種樹鼩,受環(huán)境和地理因素等影響導(dǎo)致樹鼩體內(nèi)腸道菌群有一定差異,同時(shí)樹鼩檢測(cè)數(shù)量還不是很多,今后應(yīng)進(jìn)一步增加檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)樹鼩數(shù)量,在不同時(shí)間再次進(jìn)行培養(yǎng)。 下一步將深入開展瑤山亞種樹鼩馴化過程中優(yōu)勢(shì)菌群的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),特別是通過檢測(cè)糞便中細(xì)菌的變化情況,了解瑤山亞種樹鼩在馴化過程中不同部位菌群在種群分布、數(shù)量的變化。 以期找出瑤山亞種樹鼩的優(yōu)勢(shì)菌群及與疾病相關(guān)的生物物種標(biāo)記。 同時(shí)對(duì)引起瑤山亞種樹鼩內(nèi)源性與外源性感染的微生物的研究,初步建立瑤山亞種樹鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制體系,為今后建立相應(yīng)的瑤山亞種樹鼩病原微生物檢測(cè)地方標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

表2 樹鼩腸道細(xì)菌對(duì)常見抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Sensitivity experiment results of intestinal bacteria of the tree shrew to common antibiotics

通過頭孢類藥物對(duì)瑤山亞種樹鼩腸道細(xì)菌敏感性分析,發(fā)現(xiàn)頭孢唑啉耐藥率最高、頭孢西丁次之、頭孢他啶對(duì)細(xì)菌的敏感程度最高。 這與頭孢類抗菌素的抗菌原理和使用頻率相符合。頭孢唑林是一代頭孢類藥物、頭孢西丁是二代頭孢類藥物、頭孢他啶為三代頭孢類藥物。 一代頭孢對(duì)大腸埃希菌、變形桿菌等腸桿菌普遍有抑制作用,而本研究發(fā)現(xiàn)有1 株大腸桿菌、1 株弗氏檸檬酸桿菌、1 株變形桿菌對(duì)頭孢西丁耐藥。 耐藥的機(jī)制和原因未明,這將是將來我們重點(diǎn)關(guān)注的問題之一。 頭孢類藥物對(duì)腸球菌沒有作用這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)論相符,因此在實(shí)際工作中更應(yīng)該注意根據(jù)細(xì)菌類型選用適合的抗菌藥物來治療感染。

針對(duì)革蘭陽(yáng)性的球菌和桿菌,本研究進(jìn)一步選用了紅霉素、青霉素和氨芐西林進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明腸球菌對(duì)這三種藥物的耐藥率高,紅霉素、氨芐西林尤為明顯,達(dá)到83%,青霉素次之。 說明腸球菌易產(chǎn)生耐藥性。

針對(duì)革蘭陰性菌,本研究進(jìn)一步選用了慶大霉素、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明三種藥物進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明瑤山亞種樹鼩腸道陰性菌對(duì)慶大霉素和左氧氟沙星敏感,而對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率達(dá)92%。 而對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星普遍敏感。 大腸埃希菌、弗氏檸檬酸桿菌、腸球菌均是腸道的長(zhǎng)居菌,而菌群的耐藥性改變有可能是引起內(nèi)源性感染的原因之一。 通過本研究表明,瑤山亞種樹鼩腸道細(xì)菌對(duì)頭孢唑林、頭孢西丁、紅霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明均存在不同程度的耐藥的菌株,而對(duì)左氧氟沙星、慶大霉素和青霉素的耐藥菌較少。 這提示我們?cè)谶M(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物監(jiān)測(cè)的時(shí)候,不僅僅要關(guān)注野生瑤山亞種樹鼩引起人畜共患病的病原體的感染情況,也應(yīng)該重視一些長(zhǎng)居菌群在種類、耐藥性變異情況的監(jiān)測(cè)。

廣西野生瑤山亞種樹鼩糞便分離鑒定的菌落,經(jīng)16S rRNA 序列分析,共鑒定出7 科13 屬20 種細(xì)菌,包括豚鼠氣單胞菌、假單胞菌、雷氏普羅威登斯菌、弗氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌、費(fèi)革森埃希菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、普通變形桿菌、羽狀變形桿菌、普羅威登斯菌、松鼠葡萄球菌、溶血葡萄球菌等多種常見致病或條件性致病菌。 在樹鼩特別是瑤山亞種樹鼩消化道,這些潛在的病原細(xì)菌絕大多數(shù)都是首次報(bào)道,本研究為野生瑤山亞種樹鼩的馴養(yǎng)及相關(guān)疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。