宰青青，葉 蘭，秦 臻，潘 婷

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

衰老是復(fù)雜多變的一個(gè)過程，也是生物體發(fā)展的必定趨向。構(gòu)成生物體的單位是細(xì)胞，所以細(xì)胞的衰老是造成整個(gè)機(jī)體衰老的前提。EPCs是能分化成內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞，有非常強(qiáng)的增殖能力，分布在骨髓和外周血等組織里，可以促進(jìn)損傷內(nèi)皮的修復(fù)和參與新生血管的生成[1]。遺傳因素和機(jī)體自身環(huán)境都會對其功能和增殖分化能力造成影響。研究表明伴隨機(jī)體的衰老，EPCs會表現(xiàn)出動(dòng)員不夠、數(shù)目變少、增殖分化能力顯著下降等老化的現(xiàn)象，此外，衰老機(jī)體自身的危險(xiǎn)因素也會加快EPCs的衰老，使其難以發(fā)揮對血管內(nèi)皮的更新和修復(fù)作用[2-3]。姜黃素是一種抗衰老的中藥且具有安全有效特點(diǎn)，通過觀察實(shí)驗(yàn)中姜黃素對衰老大鼠骨髓源性EPCs功能影響，探討姜黃素對衰老EPCs機(jī)制可能的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠50只，體重在210～270g，本次實(shí)驗(yàn)大鼠來源于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)的大鼠，合格證號：SCXK（黔）2018-0001。

1.2 主要試劑和儀器

姜黃素（Sigma公司）；D-半乳糖（Sigma公司）；M199培養(yǎng)液（HyClone公司）；胎牛血清（PAA公司）；D i l 標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝ㄞ仍瓷锟萍加邢薰荆籉ITC標(biāo)記的荊豆凝集素1（Sigma公司）；transwell小室（Corning公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司）；酶標(biāo)儀（Bio-tek公司）；熒光顯微鏡（OLYMPUS公司）。

1.3 動(dòng)物分組處理

按體重將SD雄性大鼠隨機(jī)分成5組，即對照組、模型組和姜黃素高、中、低劑量組各10只。參照文獻(xiàn)方法造模[4]，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組天天腹腔注射D-半乳糖100 mg/kg，持續(xù)60天，注射的同時(shí)干預(yù)給藥。姜黃素高、中、低劑量組每天予以400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg姜黃素進(jìn)行灌胃，同時(shí)另外兩組灌胃等量的生理鹽水，持續(xù)60天。

1.4 EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定[5]

脫頸處死大鼠后，無菌環(huán)境下進(jìn)行股骨和脛骨的分離，用M199培養(yǎng)液將細(xì)胞沖至離心管中，對200目細(xì)胞進(jìn)行篩濾，1000 r/min×5 min離心后重懸；將重懸液按1：1慢慢加到大鼠骨髓淋巴細(xì)胞分離液的上面，2000 r/min×20 min離心，小心的用吸管吸出位于第二層的單個(gè)核細(xì)胞層，然后用M199培養(yǎng)液1500 r/min×5 min離心洗滌兩次。用M199全培養(yǎng)液重懸后計(jì)數(shù)，以5×106cells/mL的接種在24孔板上，各組細(xì)胞分別置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，3d換液1次。

將培養(yǎng)至第7 d的貼壁細(xì)胞棄上清，先加入含2.4 mg/L Dil-ac-LDL的M199培養(yǎng)液，1h后固定于4%多聚甲醛中，隨后再加含有10mg/L FITC-UEA-1的M199培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中作用1h，經(jīng)過PBS漂洗，避光封片處理后。 用倒置熒光顯微鏡觀察制作好的片子，吞噬ac-LDL的細(xì)胞發(fā)紅光，結(jié)合UEA-1的細(xì)胞發(fā)綠光，同時(shí)吞噬ac-LDL及結(jié)合UEA-1的細(xì)胞為正在分化的大鼠EPCs。

1.5 EPCs功能的檢測

1.5.1 EPCs細(xì)胞集落形成能力檢測

培養(yǎng)至第7 d，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)培養(yǎng)孔計(jì)算各組EPCs集落形成的數(shù)量。

1.5.2 EPCs增殖力檢測

收集各組培養(yǎng)至第7d的細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，將等量的EPCs接種于96孔板上，各組設(shè)復(fù)孔5個(gè)，細(xì)胞貼壁后加20μL5%的MTT，持續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，加150μL的二甲基亞砜充分震蕩，放入酶標(biāo)儀選用490nm測其吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 EPCs遷移力檢測

將之前收集好的各組等量細(xì)胞液加在transwell小室的上室，下室是含有50 mg/L VEGF的培養(yǎng)液，1 d后用PBS淋洗，下室中加1mL4%多聚甲醛進(jìn)行固定30 min，適當(dāng)吹干后，Geimsa染色30 min，用PBS淋洗，取出濾膜封片，隨機(jī)選5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.4 EPCs成小管力檢測

按照試劑盒操作，將膠液和稀釋液過夜凍融，900 μL膠液中加入100 μL稀釋液混勻加入96孔板，每孔50 μL，孵育l h凝固成膠；將各組細(xì)胞以5×103 cell/孔接種于膠上；培養(yǎng)1 d后，鏡下觀察小管生成狀況，隨機(jī)選5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

用SPSS 17.0軟件處理，用（±s)表示計(jì)量資料，當(dāng)方差齊性時(shí)，用單因素方差進(jìn)行組間對比分析，當(dāng)方差不齊時(shí)，用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有顯著性，P＜0.01表示差異具有極顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs 的鑒定（圖1）

貼壁細(xì)胞分別經(jīng)過Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1處理，用熒光顯微鏡觀察，同時(shí)攝取Dil-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1的細(xì)胞為所需的EPCs。

2.2 姜黃素對D-半乳糖所致衰老大鼠的骨髓EPCs功能的影響（見表1）

與對照組對比，模型組骨髓EPCs的功能嚴(yán)重受損（P＜0.05）；與模型組對比，姜黃素高、中兩個(gè)組均可提高EPCs的各項(xiàng)能力（P＜0.05，P＜0.01）。該結(jié)果顯示姜黃素可明顯改進(jìn)衰老大鼠受損EPCs的功能，延緩細(xì)胞衰老。

圖1 EPCs的鑒定（×200）

表1 姜黃素對D-半乳糖所致衰老大鼠的EPCs功能的影響（±s，n=3）

表1 姜黃素對D-半乳糖所致衰老大鼠的EPCs功能的影響（±s，n=3）

注：和對照組作比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；和模型組作比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 集落數(shù)(個(gè)) 增殖力(OD) 遷移力(cells×200) 成小管力 (cells×200)對照組 2.4±1.14* 0.31±0.02** 55.6±5.13** 36.8±7.26**模型組 0.6±0.55△ 0.22±0.04△△ 35.4±4.39△△ 22.4±3.78△△姜黃素高劑量組 2.2±1.48* 0.30±0.04** 52.4±4.39** 36.2±6.26**姜黃素中劑量組 1.8±1.30 0.28±0.03* 44.8±4.44** 31.8±4.82*姜黃素低劑量組 0.8±0.84 0.26±0.02 40.4±5.59 25.4±4.04

3 討 論

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口的老齡化，動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、癌癥等與衰老相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率日益增高，如何安全有效地延緩衰老已變成人們關(guān)注的焦點(diǎn)，因而抗衰老藥物及其機(jī)制的研究已變成目前研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示[6]姜黃素有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖等作用，對衰老的各個(gè)方面都有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過在整體水平上觀察姜黃素對EPCs衰老的干預(yù)效果，表明姜黃素可明顯增進(jìn)衰老EPCs的數(shù)目并改進(jìn)其功能，促進(jìn)衰老EPCs的活性，有效延緩細(xì)胞的老化進(jìn)程，但其具體的信號通路還需進(jìn)一步深入研究。