蘭蘭，雷方

（1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學(xué)，河南 洛陽 471000）

剝脫綜合征(exfoliation syndrome，XFS)最早由Linberg 于1917 年提出,主要癥狀是眼前段灰白色纖維狀或頭皮屑狀剝脫,沉積于瞳孔邊緣、虹膜表面、晶狀體表面和懸韌帶、前房[1]。剝脫物質(zhì)被認為是由涉及系統(tǒng)結(jié)締組織的異常細胞外基質(zhì)引起的疾病,并且與老年細胞中異常代謝過程有關(guān)[2]。這種特征性組織變化可引起廣泛的眼內(nèi)并發(fā)癥,包括青光眼、色素分散、晶狀體半脫位、瞳孔擴張、眼部房水屏障功能受損、虹膜后粘連和角膜內(nèi)皮退化[3]。青光眼是導(dǎo)致眼睛失明的原因之一,是一種以視神經(jīng)抑制和視野缺陷為特征的疾病,眼壓的病理性增加是青光眼性視神經(jīng)病變的主要危險因素,由視神經(jīng)乳頭充盈不足和缺血引起的眼內(nèi)微循環(huán)障礙是另一種致病因素[4]。本次研究選取2016 年1 月至2019 年2 月在我院治療的剝脫型青光眼患者91例，探討類賴氨酸氧化酶1（LOXL1）基因多態(tài)性與剝脫型青光眼發(fā)病的關(guān)系，研究報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2016 年 1 月至 2019 年 2 月在我院治療的剝脫型青光眼患者91 例作為觀察組,納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴診斷符合《眼科學(xué)》中的標(biāo)準(zhǔn)；⑵漢族人群；⑶患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴有眼部手術(shù)史；⑵合并有糖尿病、肝腎功能異常、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等。同時選取180 例健康志愿者作為對照組 （無青光眼等眼部疾病家族史），觀察組和對照組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 觀察組和對照組一般資料比較

1.2 檢測方法 兩組患者從常規(guī)肘靜脈抽取5ml空腹靜脈血，并用乙二胺四乙酸鈉進行抗凝，并儲存在-80℃的冰箱中。通過苯酚抽提法提取DNA，并使用PCR 法和限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測LOXL1 基因多態(tài)性的特征[7]。通過紫外分光光度計ND1000 測量 DNA 濃度和純度。光密度 （A）值(260nm/280nm)在 1.8 和 2.0 之間，并且 DNA 純度被認為是可接受的。工作濃度為100μg/ L，樣品在20℃下儲存在冰箱中,備用樣品儲存在80℃的冰箱中，以降低多個凍融樣品降解的可能性。指定特定位 點 的 引 物 ：rs2165241 (F：5'-CTCTAGGGCCCCTTGGAGAAT-3' 和 R：5'-GGCCAGAGGTCTGCTAAGCAC-3'),rs1048661 和 rs3825942(F：5'.ATTC GGClTITGGCCAGGT-3' 和 R：5'-GAACTGCTGCG GGTAGGA-3'[5])。

PCR 法 ：4μl100mg 基 因 組 DNA，20μlPCRMasterMix，1μl(10nmol/L)上游和下游引物，14μlddH20。PCR 反應(yīng)條件：rs2165241：在 94℃預(yù)變性5min, 在 94℃變性 30s, 在 65~60℃退火 1min,在72℃延伸 45s,10 個循環(huán);在 94℃變性 30s,在 60 ℃退火 1min,45℃在 72℃延伸，30 個循環(huán)后，72℃再延 長 1min，PCR 產(chǎn) 物 為 321bp。Rsl048661 和rs3825942：在 94℃預(yù)變性 5min 后, 在 94℃變性30s，在 58~55℃退火 30s，在 72℃延伸 45s，6 個循環(huán);在 94℃變性 30s,在 55℃退火 30s，在 72℃延伸45°S,29 個循環(huán)后,在 72℃進一步延伸 5min,PCR 產(chǎn)物為200 bp。將5μlPCR 產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計采用SPSS22.0 軟件，年齡采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用t 檢驗，計數(shù)資料比較使用卡方檢驗，樣本代表性采用Hardy-WeinBerg 遺傳平衡檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LOXL1 基因三位點多態(tài)性情況 LOXL1 基因rs2165241 位點基因型包括 TT、CT 和 CC，rs1048 661 位點基因型包括 GG、GT 和 TT，rs3825942 位點基因型包括 GG、GA 和 AA；觀察組合對照組LOXL1 基因 rs2165241、rs1048661 和 rs3825942 位點基因型分布符合Hardy-WeinBerg 遺傳平衡定律（P＞0.05），樣本有群體代表性。

2.2 兩組LOXL1 基因rs2165241 位點基因型及等位基因分布比較 觀察組和對照組LOXL1 基因rs2165241 位點基因型及等位基因分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 兩組LOXL1 基因rs3825942 位點基因型及等位基因分布比較 觀察組和對照組LOXL1 基因rs3825942 位點基因型及等位基因分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 兩組LOXL1 基因rs1048661 位點基因型及等位基因分布比較 觀察組LOXL1 基因rs1048661位點基因型GG 及等位基因G 比例明顯高于對照組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

3 討論

青光眼是由多種危險因素誘發(fā)的視神經(jīng)變性疾病。青光眼患者的視覺損傷的發(fā)病機理是由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的細胞凋亡導(dǎo)致眼內(nèi)壓升高和低灌注誘導(dǎo)的缺血導(dǎo)致視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙,從而破壞缺血條件下的血管,產(chǎn)生和平衡抗血管生成因子[4]。流行病學(xué)研究表明，XFS 發(fā)生在世界上所有地理區(qū)域，老年人和青光眼患者的發(fā)病率更高，在白種人中更為常見,但患病率不同并且隨著年齡的增長而增加，可以影響到世界范圍10%~20%的60 歲以上人群[6]。原發(fā)性青光眼分為閉角型和開角型，不同區(qū)域患者比例不同。中國原發(fā)性閉角型青光眼與原發(fā)性開角型青光眼的比例為3.7：1, 新加坡為4.5：1，日本為 1：7.7，歐美國家為 1：5.7[7]。TGFβ 信號通路在人小梁網(wǎng)細胞中誘導(dǎo)LOX 基因的表達，提示該基因可能影響由眼壓和房水流出阻力引起的青光眼[8]。

表2 兩組LOXL1 基因rs2165241 位點基因型及等位基因分布比較

表3 兩組LOXL1 基因rs3825942 位點基因型及等位基因分布比較

表4 兩組LOXL1 基因rs1048661 位點基因型及等位基因分布比較

LOXL1 是賴氨酸氧化酶家族的成員。賴氨酸氧化酶是含銅的細胞外酶,編碼的蛋白質(zhì)具有多種生物學(xué)功能,其功能是通過賴氨酸氧化脫乙?；蛸嚢彼岬牧u基側(cè)鏈?zhǔn)阶饔么呋z原蛋白和彈性蛋白在結(jié)締組織中的共價交聯(lián),其產(chǎn)物是彈性纖維系統(tǒng)形成的關(guān)鍵酶[8]，家族包括五個特殊成員：賴氨酸氧化酶（LOX）和賴氨酸氧化酶樣1-4（LOXL1，LOXL2，LOXL3 和 LOXL4）[9]。LOXL1 是細胞外基質(zhì)代謝中的關(guān)鍵交聯(lián)酶，位于15q22，編碼賴氨酸氧化家族的成員,其在交聯(lián)的膠原蛋白和彈性蛋白中形成，在彈性纖維的形成，維持和重塑中起重要作用[10]。通過對子宮內(nèi)膜異位癥中LOXL1 基因表達的研究，LOXL1 可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過程, 這與盆腔器官組織脫垂的程度有關(guān)[11]。Thorleifsson[12]等人通過研究剝脫性青光眼LO XL1 的常見序列變異, 發(fā)現(xiàn)LOXL1 與剝脫性青光眼之間存在顯著相關(guān)性。

2007 年，Thorleifsson 等[13]報道了 LOXL1 基因中的3 個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點,而rs2165 241，rs3825942 和 rs104866l 與剝脫性青光眼有很強的相關(guān)性。許多研究證實，LOXL1 基因等位基因頻率，基因型，基因單倍型和復(fù)雜基因型在不同人群中存在差異，LOXL1 基因多態(tài)性是導(dǎo)致剝脫性青光眼遺傳易感性的一個因素[14-16]。本次研究結(jié)果顯示LOXL1 基因rs2165241 位點基因型包括TT、CT 和 CC，rs1048661 位點基因型包括 GG、GT 和TT，rs3825942 位點基因型包括 GG、GA 和 AA；觀察組合對照組 LOXL1 基因 rs2165241、rs1048661和rs3825942 位點基因型分布符合Hardy-Wein-Berg 遺傳平衡定律（P＞0.05），樣本有群體代表性。兩組LOXL1 基因位點基因型及等位基因分布比較，觀察組和對照組LOXL1 基因rs2165241 位點和rs3825942weid 基因型及等位基因分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，觀察組LOXL1 基因rs1048661位點基因型GG 及等位基因G 比例分別為62.64%和80.22%，明顯高于對照組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義。顯示與XFS 患者的遺傳易感性相關(guān)，并且每個多態(tài)性位點具有較強的相關(guān)性，rs2165241 位點的基因型TT 是危險的基因型，等位基因T 是危險的等位基因，即相同區(qū)域內(nèi)全血DNA 分析rs2165241位點TT 基因型和T 等位基因的發(fā)生與XFS 呈正相關(guān)。Rsl048661 位點的等位基因G 是一個危險的等位基因，即同一區(qū)域群體的全血DNA 檢測分析與rsl048661 位點的G 等位基因中XFS 的發(fā)生呈正相關(guān)。Rs3825942 位點的等位基因G 是一個危險的等位基因，即同一區(qū)域群體的全血DNA 檢測分析與rs3825942 位點G 等位基因中XFS 的發(fā)生呈正相關(guān)[17]。

綜上所述，LOXL1 基因rs1048661 位點多態(tài)性與剝脫型青光眼發(fā)病可能有一定關(guān)系，LOXLl 基因可能是剝脫性青光眼的主要遺傳危險因素，值得進一步研究。