劉 義，楊 浩，吳 迪，李 驊，趙智君

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032；2.重慶渝北區(qū)人民醫(yī)院骨科，重慶 401120）

關(guān)節(jié)軟骨缺乏血供，基質(zhì)中軟骨細(xì)胞稀疏，缺乏分裂增生能力，其自身修復(fù)能力有限，關(guān)節(jié)軟骨損傷通常會引發(fā)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)軟骨退變。在關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療中，臨床采用的技術(shù)包括骨髓刺激術(shù)（軟骨下骨鉆孔、微骨折等）、同種骨軟骨移植、馬賽克軟骨移植及基于自體軟骨細(xì)胞移植的ACI和MACI。骨髓刺激術(shù)通常在局部形成纖維軟骨，而結(jié)合ACI或者M(jìn)ACI，可以形成透明軟骨樣組織，具有較好的遠(yuǎn)期效果[1]。MACI基于組織工程技術(shù)，將體外擴增的自體軟骨細(xì)胞種植于支架材料中進(jìn)行移植，其關(guān)鍵技術(shù)在于軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及制備理想的支架材料。

1 材 料

1.1 實驗動物

取昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的6只成年新西蘭大白兔，周領(lǐng)34～37周，體重1.8～2.2 kg。

1.2 主要試劑和儀器（見表1）

表1 主要儀器和試劑

2 方 法

2.1 軟骨細(xì)胞獲取

取6只成年新西蘭大耳白兔（昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），體重1.8～2 kg，空氣栓塞處死，切取股骨內(nèi)、外側(cè)髁軟骨，置入裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中。

生理鹽水沖洗軟骨塊三遍，使用手術(shù)刀片將其切為0.5 mm3大小的碎粒，用吸管移入離心管中1000 rpm離心10 min，去上清液，加入十倍左右的0.1﹪Ⅱ型膠原酶置入培養(yǎng)箱消化8小時，可見軟骨顆粒大部分消化，取出后，放入恒溫?fù)u床中，37℃ 120 r/min消化1小時，可見軟骨顆粒完全消化。l000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀用30倍的PBS平衡液清洗、離心3遍后，在高糖DMEM完全培養(yǎng)基中加入，其含谷氨酰胺292 mg/L+維生素C 50 mg/L+10%胎牛血清+1%雙抗液，混勻后，轉(zhuǎn)移至25 ml普通培養(yǎng)瓶中，在37℃、5﹪CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)的觀察與傳代

（1）軟骨細(xì)胞的活性檢測及傳代培養(yǎng)：將10 g/L的臺盼盤藍(lán)液與原代細(xì)胞懸液以1：9的比例滴入離心管中，混勻后放置2～3 min，取一滴均勻分散于計數(shù)板，計算活細(xì)胞數(shù)。

（2）倒置顯微鏡下觀察原代細(xì)胞貼壁時間，各代細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況差異等。

（3）傳代培養(yǎng)：軟骨細(xì)胞融合達(dá)80～90%時，使用0.125%的胰蛋白酶消化，以1：2的比例傳代。

2.3 軟骨細(xì)胞的鑒定

2.3.1 細(xì)胞爬片

將第二代軟骨細(xì)胞制成1×106/ml濃度，滴加至蓋玻片（硅化處理）上，置于培養(yǎng)箱中，6小時后，細(xì)胞完成貼壁，再向培養(yǎng)板中加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中。24小時后取出蓋玻片，用PBS液洗兩次后4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，吸水紙吸干殘留液體，中性樹膠粘貼于載玻片上等待染色。

2.3.2 Mallory特染

將1%Triton-x-100滴加至爬片，室溫下作用30分鐘，PBS液洗三次，共5分鐘。蘇木素染色2～3分鐘。蒸餾水洗，0.5%鹽酸乙醇分化。蒸餾水洗，至返藍(lán)為止。蒸餾水洗，滴加酸性復(fù)紅水溶液，作用5分鐘。不經(jīng)水洗，直接滴加Mal1ory苯胺藍(lán)-橘黃G溶液，作用10分鐘。過95%乙醇及無水乙醇分化兼脫水。中性樹膠封片，鏡下觀察。

2.3.3 甲苯胺藍(lán)染色

PBS液漂洗細(xì)胞爬片2次，95%酒精固定15分鐘，PBS液漂洗3次，每次1分鐘。滴加1%甲苯胺藍(lán)染液。蒸餾水洗。經(jīng)70%、80%、90%酒精各1次，95%酒精2次和100%酒精3次逐級脫水，每次1分鐘。二甲苯透明3次，每次1分鐘。中性樹膠封片，鏡下觀察。

2.3.4 II型膠原免疫組化染色

滴加1% Triton-x-100至細(xì)胞爬片，室溫下作用30分鐘，予PBS液洗三次，共5分鐘。滴加3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，PBS液沖洗3次，3分鐘/次。吸去PBS，滴加Ⅱ型膠原單克隆抗體，濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜。PBS液沖洗3次，5分鐘/次，吸去PBS后滴加聚合物增強劑，室溫下孵育20分鐘，PBS沖洗3次，3分鐘/次。吸去PBS，滴加酶標(biāo)抗羊/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘，PBS沖洗3次，3分鐘/次。吸去PBS，滴加DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5分鐘，顯色效果滿意時終止染色。自來水沖洗后蘇木素復(fù)染，梯度酒精逐級脫水干燥，中性樹膠封固，鏡下觀察。

2.4 組織工程軟骨檢測

2.4.1 藻酸鈉凝膠的制備

分析純低粘度藻酸鈉溶于含有0.15 mol/l的NaCl的溶液中，使藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2℅，磁力攪拌機攪拌，pH值調(diào)為7.4。0.22 μm濾網(wǎng)過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 種子細(xì)胞的準(zhǔn)備

第二代軟骨細(xì)胞消化后，吹打制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后將細(xì)胞懸液置入50 ml尖底離心管，待全部細(xì)胞收集完后，1000 r/min×10 min離心，去上清后等待接種。

2.4.3 藻酸鈣-軟骨細(xì)胞凝珠及空白藻酸鈣凝珠的制備

第二代軟骨細(xì)胞消化后，1000 rpm離心10 min，去上清液后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。用1.2%藻酸鈉溶液調(diào)至細(xì)胞密度為5×106/ml，吸入10 ml注射器中，以較慢的速度在40 ml CaCl2溶液中滴入該混合溶液，CaCl2溶液濃度為102 mMol/l，第一時間交聯(lián)促進(jìn)凝珠的形成，室溫下進(jìn)行12 min反應(yīng)，從而將最佳的交聯(lián)效果獲取過來。將CaCl2溶液吸出來，用0.15 mol/l NaCl溶液反復(fù)沖洗4次，高糖DMEM完全培養(yǎng)液沖洗1次。將凝珠移入6孔培養(yǎng)板中，每孔植入8～10枚凝珠為宜，加入高糖DMEM完全培養(yǎng)液，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每三天換液一次，共4周（圖1）。以同樣方法制備不含軟骨細(xì)胞的空白藻酸鈣凝珠。

2.4.4 細(xì)胞－載體復(fù)合物及空白載體倒置相差顯微鏡下觀察、冰凍切片HE染色、II型膠原免疫組化染色

在細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作實驗臺中，從6孔培養(yǎng)板中取出2枚藻酸鈣-軟骨細(xì)胞凝珠于無菌25ml培養(yǎng)瓶中，置于倒置相差顯微鏡下觀察藻酸鈣-軟骨細(xì)胞凝珠內(nèi)部成分。將培養(yǎng)4周的藻酸鈣-軟骨細(xì)胞凝珠隨機取出，行冰凍切片HE染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色。

2.4.5 II型膠原mRNA RT-PCR檢測

取單層培養(yǎng)的第二代軟骨細(xì)胞和支架內(nèi)培養(yǎng)至1、4周的軟骨細(xì)胞進(jìn)行II型膠原mRNA RT-PCR檢測，空白藻酸鈣支架作為對照。使用Primer Express 3.0軟件（美國ABI公司）設(shè)計家兔Ⅱ型膠原基因引物，由上海生工合成，從NCBI GeneBank尋找家兔Ⅱ型膠原基因的mRNA序列，基因編號D83228.1。引物序列：上游、下游分別為5’-CCA AGA AGA ACT GGT GGA GC-3’、5’-TAG GTG ATG TTC TGG GAG CC-3’。長度、退火溫度分別為178 bp、60℃，根據(jù)Trizol說明書提取RNA，PCR條件為在95℃、94℃、61℃、72℃的溫度下分別進(jìn)行10 min的預(yù)變性、15 s的變性、20 s的退火、50 s的延伸，35個循環(huán)，最后在72℃的溫度下進(jìn)行2 min的延伸。用2%凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

3 結(jié) 果

（1）原代細(xì)胞接種后24小時開始貼壁，之后逐漸有細(xì)胞從團塊中爬出貼壁，為三角形或多角型，7～10天后融合達(dá)80～90%，成鋪路卵石狀。傳代細(xì)胞貼壁加快，約接種后2小時開始貼壁，12小時完成貼壁，3天融合達(dá)80～90%，傳代至第四代后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，有較多偽足伸出，細(xì)胞生長減慢。

（2）臺盼藍(lán)拒染測得活性率為95.8﹪。

第三代軟骨細(xì)胞爬片甲苯胺藍(lán)染色圖×100

（3）軟骨細(xì)胞爬片甲苯胺藍(lán)染色，可見胞質(zhì)中有紫紅色異染顆粒。

（4）Mallory染色可見軟骨細(xì)胞胞漿呈深藍(lán)色。

第三代軟骨細(xì)胞Mallory染色呈陽性×100圖

（5）軟骨細(xì)胞爬片II型膠原染色見胞漿呈棕黃色，細(xì)胞核藍(lán)染。

第三挖潛軟骨細(xì)胞II型膠原免疫組化染色陽性×100圖

（6）空白藻酸鈣凝珠載體呈水滴狀，白色半透明，有一定的強度和韌性。直徑約為3 mm。冰凍切片經(jīng)HE染色，可見藍(lán)染纖維狀結(jié)構(gòu)交織成網(wǎng)狀，網(wǎng)眼較均勻一致。

藻酸鈣凝珠外觀，直徑約3mm；空白藻酸鈣凝珠冰凍切片HE染色×100

（7）藻酸鈣復(fù)合軟骨細(xì)胞懸液制成藻酸鈣-軟骨細(xì)胞凝珠后，直徑約3 mm，倒置相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)凝珠內(nèi)部軟骨細(xì)胞呈圓形，單個散在分布。培養(yǎng)4周后，倒置相差顯微鏡下可見大量軟骨細(xì)胞單個或團狀散在分布在藻酸鈣載體中，單個細(xì)胞呈圓形且透亮，細(xì)胞澤光性好，分布密集、均勻，培養(yǎng)4周后材料內(nèi)部軟骨細(xì)胞數(shù)目明顯較培養(yǎng)前多。HE染色可見載體材料被染成淡藍(lán)色，藍(lán)染的軟骨細(xì)胞位于材料的網(wǎng)狀空隙中，數(shù)目較多。培養(yǎng)4周后的藻酸鈣-軟骨細(xì)胞凝珠Ⅱ型膠原免疫組化染色，可觀察到載體中軟骨細(xì)胞胞漿及載體材料內(nèi)部均被染成棕黃色，細(xì)胞核染為淡藍(lán)色。

倒置相差顯微鏡下觀察×100；4周后倒置相差顯微鏡下觀察×100；冰凍切片HE染色×100；II型膠原免疫組化染色×100

（8）第二代單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和復(fù)合藻酸鈣后培養(yǎng)至1、4周的軟骨細(xì)胞，經(jīng)凝膠電泳鑒定，II型膠原mRNA RT-PCR產(chǎn)物均在178bp處出現(xiàn)陽性條帶，空白支架處未出現(xiàn)條帶。

4 討 論

在本實驗中，軟骨細(xì)胞在復(fù)合海藻酸鈉水凝膠材料后第一時間將其原形恢復(fù)過來，終呈橢圓形或圓形。HE染色可見藍(lán)染的軟骨細(xì)胞散在分布于類似軟骨陷窩的網(wǎng)狀晶格中。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)顯示細(xì)胞具有旺盛的Ⅱ型膠原分泌，說明海藻酸鈉載體培養(yǎng)極好地維持了軟骨細(xì)胞表型。在軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)中，將海藻酸鈉充分利用起來一方面不會引發(fā)去分化現(xiàn)象，另一方面還能夠?qū)?xì)胞的球形形態(tài)進(jìn)行長期維持，而在軟骨細(xì)胞表型的穩(wěn)定中，維持球形結(jié)構(gòu)具有極為重要的作用。本實驗也表明，海藻酸鈉中軟骨細(xì)胞呈球形，生長呈叢狀，免疫學(xué)、組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)有Ⅱ型膠原、蛋白聚糖出現(xiàn)在細(xì)胞周圍，其為軟骨細(xì)胞所特有，分泌主體為軟骨細(xì)胞，隨著時間的延長逐漸增多，軟骨細(xì)胞海藻酸鈉凝膠強度也隨著這些軟骨基質(zhì)數(shù)量的增加而提升。從這里我們可以看出，經(jīng)體外培養(yǎng)的功能正常的海藻酸鈉復(fù)合兔軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外短期培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞支架復(fù)合物形成后進(jìn)一步體內(nèi)實驗的條件具備。

5 結(jié) 論

酶消化結(jié)合振蕩培養(yǎng)消化法具有較高的軟骨組織消化率，實驗構(gòu)建的組織工程軟骨具有軟骨組織的特征。