李旺輝 蘇達(dá)永 強(qiáng)瑞雪 郝志宏 于 力

1.廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院兒科（廣東廣州 510730）；2.廣州市第一人民醫(yī)院兒科（廣東廣州 510180）

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是兒科常見的疾病，可分為激素敏感型腎病綜合征（steroid -sensitive nephrotic syndrome，SSNS）和激素耐藥型腎病綜合征（steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS）[1]。SRNS患兒預(yù)后差，反復(fù)遷延不愈者最終發(fā)展至終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD），需要腎替代治療[2]，是臨床中非常棘手的問(wèn)題。因此，尋找導(dǎo)致SRNS根源一直是研究的熱點(diǎn)。目前已明確多種基因突變可導(dǎo)致SRNS，尤其是編碼足細(xì)胞骨架分子相關(guān)蛋白的單基因突變?cè)赟RNS 中發(fā)揮重要的作用[3-6]。目前研究表明，8 個(gè)不同的單基因突變能夠?qū)е耂RNS，包括NPHSl，NPHS 2，WT 1，ACTN4，CD2AP，TRPC6，LAMB2，PLCE1等。其中PLCE1基因則是近年新發(fā)現(xiàn)的與兒童SRNS相關(guān)的基因[7-8]。文章總結(jié)1 例因PLCE 1基因突變致SRNS 患兒的臨床特征和基因變異的特點(diǎn)，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)。

1 臨床資料

患兒，女，2009年2月出生，起病年齡2歲，臨床診斷為PNS。父母親體健，非近親婚配；否認(rèn)家族遺傳性疾病史?；純阂騊NS 多次復(fù)發(fā)，先后采用激素、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A、他克莫司和嗎替麥考酚酯等治療，尿蛋白一直呈陽(yáng)性，多次住院治療。5歲時(shí)第一次腎穿刺病理檢測(cè)為“系膜增生性腎小球腎炎（輕-中度）”；7 歲時(shí)第二次腎穿刺病理為“局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal and segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）”。常規(guī)詢問(wèn)病史、體格檢查、乙肝血清學(xué)檢查、淋巴細(xì)胞CD 系列檢測(cè)、血糖、胸透及心電圖檢查結(jié)果，除外其他系統(tǒng)疾病。尿沉渣中蛋白質(zhì)＋＋＋、紅細(xì)胞30～50/HP，白細(xì)胞2～5/HP；24小時(shí)尿蛋白定量7 428 mg/d。

考慮患兒原發(fā)性腎病綜合征起病年齡小，頻繁復(fù)發(fā)，激素耐藥，腎臟病理為FSGS，多種免疫抑制劑聯(lián)合治療效果不佳，激素不良反應(yīng)增加。患兒9 歲時(shí)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)、監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書后，抽取患兒及其父母各2 mL 外周血，置EDTA 抗凝管中混勻，送嘉檢醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司行腎病綜合征磷脂酶Cε1 (phospholipase C epsilon-1，PLCE1) 基因外顯子DNA 檢測(cè)，并結(jié)合患兒臨床特征、突變預(yù)測(cè)、突變位點(diǎn)正常人頻率、突變類型等，采用Sanger測(cè)序方法驗(yàn)證患兒及其父母相關(guān)的基因變異位點(diǎn)。

基因序列分析顯示，患兒外周血細(xì)胞檢測(cè)到PLCE1基因的兩個(gè)雜合變異c.577G＞A（p.V193I）和c.2770G＞A（p.G924S），見圖1。Sanger 測(cè)序驗(yàn)證顯示，c.577G＞A（p.V193I）基因變異來(lái)自患兒母親（雜合狀態(tài)）；患兒父母均無(wú)c.2770G＞A（p.G924S）基因變異，為新發(fā)突變。c.577G＞A（p.V193I）和c.2770G＞A（p.G924S）變異均為罕見的錯(cuò)義變異，曾在相關(guān)PNS病例中被報(bào)道，為致病性變異（PMID24533735）。到目前為止，這2個(gè)變異在參考人群基因數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率較低，變異所在區(qū)域不同物種的氨基酸序列中度保守，分析預(yù)測(cè)這2個(gè)變異可能影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能?；純鹤罱K確診為PNS（腎炎型，激素耐藥型，PLCE1基因突變）。明確診斷后，患兒應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素A治療，并獲得緩解。

2 討論

PLCE1基因定位于常染色體10q23.32-q24.1，全長(zhǎng)297581 bp，共含有33 個(gè)外顯子。其編碼蛋白為磷脂酶Cε 1（phospholipase C epsilon-1，PLCε 1）。PLCε 1 蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的一種磷脂酶C（phospholipase C，PLC）同工酶，在成熟的腎小球足細(xì)胞表達(dá)，參與腎小球毛細(xì)血管袢的形成和正常發(fā)育[9]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，PLCEl基因突變可以引起常染色體隱性遺傳性腎病綜合征。PLCEl基因移碼或無(wú)義突變可導(dǎo)致嬰兒早發(fā)性腎病綜合征，其病理特征為彌漫性腎小球硬化（diffuse mesangial sclerosis，DMS）；而錯(cuò)義突變可導(dǎo)致FSGS[10]。2006年研究者揭示了PLCE1基因的結(jié)構(gòu)，并用全基因組連鎖分析的方法證實(shí)PLCE1基因的突變導(dǎo)致家族性常染色體隱性遺傳型腎病綜合征以來(lái)，共發(fā)現(xiàn)了13種PLCE1基因突變可導(dǎo)致SRNS，這13 種突變可分為5 種類型：4 種無(wú)義突變、5 種堿基小缺失、1種堿基小插入、1種錯(cuò)義突變和2種剪接突變，分別發(fā)生在PLCE1基因第2、3、10、14、16、18、21、24、25、29外顯子和第9、14內(nèi)含子上[11]。據(jù)報(bào)道，13種突變均為點(diǎn)突變，尚未發(fā)現(xiàn)基因的重組或大片段缺失[12]。

圖1 PLCE1 基因驗(yàn)證測(cè)序圖

研究發(fā)現(xiàn)，純合的PLCE1突變可導(dǎo)致腎臟發(fā)育異常并減少蛋白podocin和nephrin的表達(dá)而增加發(fā)生腎病綜合征的易感性[13]；也有學(xué)者認(rèn)為突變的PLCE 1可降低足細(xì)胞遷移率誘發(fā)類固醇抵抗性腎病綜合征[14]。雖然目前對(duì)于PLCE1造成腎病綜合征的具體機(jī)制尚不清楚，但眾多的研究已讓人們對(duì)不同類型PLCE 1突變致病特點(diǎn)有了初步的了解。具有PLCEl基因純合移碼或無(wú)義突變可導(dǎo)致PLCE 1酶功能缺乏使腎小球發(fā)育停止，導(dǎo)致腎臟形態(tài)學(xué)或功能異常，引起早發(fā)性的DSM；PLCEl基因純合錯(cuò)義突變可導(dǎo)致PLCE1酶活性下降而使腎小球血管慢性損傷，引起發(fā)病較晚的FSGS[15]。DMS是先天性腎病綜合征的特殊類型，其主要臨床特征為出生后1年內(nèi)發(fā)病，常于5歲前迅速進(jìn)展至終末期腎衰竭，而FSGS 蛋白尿的初發(fā)年齡相對(duì)較晚，進(jìn)展到ESRD的時(shí)間較DMS慢。目前對(duì)于突變的PLCE 1導(dǎo)致DMS 的觀點(diǎn)尚有爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為PLCE1突變是導(dǎo)致DMS的主要因素，但也有研究發(fā)現(xiàn)2例激素耐藥型腎病綜合征兒童的父親同時(shí)也被發(fā)現(xiàn)有同樣的PLCE1基因突變,但其父親均無(wú)腎病綜合征表現(xiàn)，故不排除其他致病基因可能[12]。

臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，利用全外顯子組測(cè)序檢測(cè)PLCE1在診斷類固醇抵抗性腎病綜合征及其治療中有重要的實(shí)用價(jià)值。國(guó)外研究顯示，PLCE 1、NPHS 2和SMARCAL1是檢測(cè)到的最常見的基因變異[16]。然而國(guó)內(nèi)研究顯示，PLCE1變異發(fā)現(xiàn)率僅為5.6%[17]，NPHS1和PLCE1可能是最常見的變異類型[18]。PLCE1基因變異所致SRNS具有一定的家族遺傳性及年齡分布特點(diǎn)。研究顯示，0～6歲的SRNS患兒中可檢出PLCE1變異，其中以3～12 月齡檢出率最高，而6 歲后再無(wú)PLCE 1變異檢出[19]。因此，PLCE 1基因變異所致的SRNS 具有一定的早發(fā)性，且臨床病理以DMS 和FSGS 為主，大多對(duì)激素和各種免疫抑制劑耐藥且預(yù)后較差，其原因可能是PLCE 1基因變異區(qū)位于EF 手型(EF-hand)結(jié)構(gòu)域；結(jié)構(gòu)域上，而EF結(jié)構(gòu)域中的第1021～1030個(gè)氨基酸是金屬離子結(jié)合的位點(diǎn)，主要參與酶的催化合成，當(dāng)PLCE1基因發(fā)生變異時(shí)，機(jī)體無(wú)法完成正常的蛋白翻譯，容易產(chǎn)生SRNS[20-21]。以往報(bào)道，由基因變異引起的腎病綜合征患兒對(duì)糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑治療都無(wú)明顯效應(yīng)。如PLCE 1基因錯(cuò)義變異所致的2 例SRNS 患兒的發(fā)病年齡分別為2歲和8歲10月齡，且分別于5歲和 12歲進(jìn)展到ESRD[22]；亦有攜帶PLCE 1基因無(wú)義變異的腎病綜合征患兒對(duì)激素或環(huán)孢素A 治療有效報(bào)道[13]。提示PLCE 1變異引起的腎病綜合征對(duì)糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素有一定的敏感性，但其藥物作用機(jī)制尚不明確。

本例患兒為PNS，激素耐藥型。患兒起病年齡小，從最初的頻繁復(fù)發(fā)到激素耐藥，腎臟病理為FSGS，多種免疫抑制劑聯(lián)合治療效果不佳，激素的不良發(fā)育增加?；純篜LCE1基因存在2個(gè)雜合錯(cuò)義變異 c.577G＞A（p.V193I）和c.2770G＞A（p.G924S），其中c.577G＞A（p.V 193 I）來(lái)自患兒母親（雜合變異），c.2770 G＞A（p.G 924 S）為新發(fā)變異，均為已報(bào)道的致病性變異。這2個(gè)變異在參考人群基因數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率較低，變異所在區(qū)域不同物種的氨基酸序列中度保守，預(yù)測(cè)這2個(gè)變異可能影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，使患兒激素耐藥，多種免疫抑制劑效果不佳；因隨訪期限尚不足，其遠(yuǎn)期預(yù)后尚不明確。

PLCE 1變異可導(dǎo)致早發(fā)性腎病綜合征，在所有具有基因純合移碼的個(gè)體中，其腎臟病理為DMS；而在具有錯(cuò)義變異的個(gè)體中，其腎臟病理則表現(xiàn)為FSGS，因此PLCE1變異可導(dǎo)致從嚴(yán)重的早發(fā)性DMS到FSGS 的一系列組織學(xué)表型。腎臟病理為DMS 的PLCE 1變異的個(gè)體的腎小球未成熟，且腎組織中Nephrin與Podocin蛋白表達(dá)也會(huì)降低，表明PLCE1對(duì)于毛細(xì)血管環(huán)階段的腎小球的正常發(fā)育至關(guān)重要[23]。值得注意的是，PLCE1變異引起的PNS對(duì)糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素有一定的敏感性。這可能是由于在腎小球發(fā)育過(guò)程中存在著關(guān)鍵時(shí)間窗，而在此期間使用糖皮質(zhì)激素或環(huán)孢菌素A 治療可以改善PLCE 1功能喪失所帶來(lái)的腎小球發(fā)育缺陷。因此，這種治療方式僅僅適用PLCEl基因純合移碼或無(wú)義變異所導(dǎo)致的早期彌漫性腎小球硬化而不是錯(cuò)義變異的PLCE 1導(dǎo)致的晚發(fā)性腎病綜合征局灶節(jié)段性腎小球硬化。這可能意味著錯(cuò)義變異的PLCE 1等位基因能夠保證腎小球的適當(dāng)發(fā)育，但在兒童后期可能會(huì)干擾腎小球修復(fù)過(guò)程，從而導(dǎo)致晚期局灶節(jié)段性腎小球硬化。這種延緩發(fā)病過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致治療關(guān)鍵時(shí)間窗喪失。后續(xù)研究需要對(duì)具有PLCE 1變異的個(gè)體及其治療反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估從而證實(shí)這些假設(shè)。

激素耐藥型腎病綜合征的治療臨床工作中的重點(diǎn)難點(diǎn)，本例患兒起病后尿蛋白一直呈陽(yáng)性，多次住院治療無(wú)改善，經(jīng)明確為PLCE1基因變異后使用糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢菌素A 治療，病情好轉(zhuǎn)。故針對(duì)SRNS患兒應(yīng)盡早行腎穿刺明確病理類型，基于病理類型選擇更有效的免疫抑制劑的治療。針對(duì)早發(fā)型腎病綜合征及SRNS 兒童應(yīng)考慮到基因突變誘發(fā)可能，盡早行基因檢測(cè)和變異位點(diǎn)分析，找出致病基因特點(diǎn)，對(duì)臨床診斷和判斷預(yù)后有重要意義。