劉亭 李朝輝 謝章明 徐迎春 吳敏良 徐笑紅 陳樞青

CYP2A13基因8種錯義突變與肺癌易感性的關(guān)聯(lián)研究

劉亭 李朝輝 謝章明 徐迎春 吳敏良 徐笑紅 陳樞青

目的 探討細胞色素p450 2A13（Cytochrome p450 2A13，CYP2A13）基因8種錯義突變與肺癌易感性的相關(guān)性。方法采用以自然人群為基礎(chǔ)的病例-對照方法，對2007-2011年間收集的91例肺癌病例以及140例年齡和性別相匹配的正常對照者進行研究。采用等位基因特異擴增法（Allele-Specific Amplification,ASA）對血液樣本中CYP2A13基因的8種錯義突變位點進行檢測。結(jié)果在對照組和病例組之間，各錯義突變位點的基因型頻率均無統(tǒng)計學的差異（均P＞0.05）：p.Arg257Cys（12.1%vs 11%）、p.Thr134_Leu135insThr（2.1%vs 1.1%）、p.Arg101Gln（7.3%vs 4.4%）、p.Phe453Tyr（2.2%vs 1.1%）、p.Arg494Cys（2.9%vs 1.1%）、p.Arg101Ter（6.6%vs 2.2%）、p.Asp158Glu（2.1%vs 1.1%）、p.Val323Leu（0.07%vs 0%）。各錯義突變位點的等位基因頻率也均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）：p.Arg257Cys（6.8%vs 5.5%）、p.Thr134_Leu135insThr（1.1%vs 0.5%）、p.Arg101Gln（4.0%vs 2.2%）、p.Phe453Tyr（1.1%vs 0.5%）、p.Arg494Cys（1.5%vs 0.5%）、p.Arg101Ter（4.0%vs 1.1%）、p.Asp158Glu（1.1%vs 0.5%）、p. Val323Leu（0.4%vs 0%）。結(jié)論中國漢族人群中存在CYP2A13基因錯義突變，但CYP2A13基因錯義突變與肺癌易感性可能不存在關(guān)聯(lián)，這提示雖然CYP2A13在肺癌發(fā)生中起到了一定作用，但可能不是影響我國漢族人群肺癌易感性的主要因素，還存在其它因素的交互影響。

肺腫瘤/遺傳學 多態(tài)性 錯義突變 CYP2A13

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與環(huán)境、遺傳等諸多因素相關(guān)，其中吸煙已經(jīng)被公認為是最重要的環(huán)境危險因素。如同幾乎所有的環(huán)境性化學毒物，煙草中的致癌物質(zhì)如NNK、尼古丁首先需要通過代謝活化才能產(chǎn)生致癌作用。細胞色素p450 2A13（cytochrome p450 2A13,CYP2A13）是一種主要在人呼吸道組織中表達的CYP亞型[1]，鼻黏膜，肺和氣管中表達量最高[2]。已有研究表明CYP2A13是參與煙草中致癌物質(zhì)4-（N-甲基-N-亞硝胺-1-（3-吡啶基）-丁酮（NNK）代謝活化的關(guān)鍵酶，而且其代謝效率在迄今所知的人CYP亞型酶中最高[2-3]，此發(fā)現(xiàn)在吸煙與肺癌關(guān)系研究領(lǐng)域受到密切關(guān)注。CYP2A13在人群中廣泛存在多態(tài)性，其外顯子區(qū)域已被人類CYP等位基因命名委員會[The Human Cytochrome p450（CYP）Allele Nomenclature Committee]確證具有9個錯義突變位點，可引起8種錯義變異體，導致CYP2A13的活性產(chǎn)生變化，從而對肺癌易感性產(chǎn)生影響[4-7]。我國肺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，可是到目前為止，尚無研究報道我國人群中CYP2A13基因錯義突變與肺癌易感性的關(guān)系?？紤]到人群遺傳背景和接觸的環(huán)境不同，在我國人群中進行CYP2A13基因多態(tài)性與肺癌發(fā)生相關(guān)性研究仍具有重要意義。因此本研究采用以自然人群為基礎(chǔ)的病例-對照方法，對CYP2A13基因錯義突變與中國漢族人群肺癌易感性的關(guān)系進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 采用以人群為基礎(chǔ)的病例對照研究。病例組91例肺癌患者，均為2007-09—2011-02浙江省腫瘤醫(yī)院住院患者。對照組140例健康成年人，其血樣收集于2011-01—04浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院臨床檢驗科。所有研究對象均為中國浙江省漢族人群，個人之間沒有血緣關(guān)系。兩組在年齡、性別和吸煙史等因素上的分布無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），詳見表1。

表1 研究對象基本情況（例）

1.2 血液樣本的收集和基因組DNA的提取 抽取研究對象2～3 ml靜脈血液，檸檬酸鈉抗凝，血液取出后立即-80℃凍存?zhèn)溆?。使用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒提取血液基因組DNA。獲得的基因組DNA經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整度、GeneQuant分光光度計測定其濃度和純度后，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 多態(tài)性位點的選擇 目前被人類CYP等位基因命名委員會收錄的CYP2A13基因錯義突變位點有9個，其中7個引起氨基酸的改變，1個引起移碼突變，還有1個過早引入終止子，共產(chǎn)生8種錯義變異體。這9個位點及其導致的氨基酸突變分別是74G＞A，p.Arg25Gln（rs8192784）；3357A＞G，p.Arg257Cys（rs8192789）；1634_1635 insACC，p.Thr134_Leu135insThr（rs57082577）；579G＞A，p.Arg101Gln（rs148044792）；7343T＞A，p.Phe453T -yr（rs72547590）；7465C＞T，p.Arg494Cys（rs138870349）；578C＞T，p.Arg101Ter（rs72552266）；1706C＞G，p.Asp158Glu（rs112337232）；5294G＞T，p.Val323Leu（尚無rs號）（http: //www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2a13.htm）。由于p.Arg25Gln和p.Arg257Cys出現(xiàn)在同一個錯義變異體，并且p. Arg25Gln位于CYP2A13蛋白跨膜區(qū)，對活性影響不大，所以本文選擇了p.Arg257Cys、p.Thr134_Leu135insThr、p.Arg101Gln、p.Phe453Tyr、p.Arg494Cys、p. Arg101Ter、p.Asp158Glu和p.Val323Leu等8個錯義突變位點作為研究對象。

1.4 基因多態(tài)性檢測 采用等位基因特異擴增法（Allele-Specific Amplification,ASA）來進行CYP2A13基因分型。首先以基因組DNA為模板，用高保真性KOD plus DNA聚合酶來擴增含有突變位點的CYP2A13基因片段L1、L2。L1片段的擴增引物為 CTTGCTACACACTCCACCTCCCAGAAACTCCAC（上游引物）和GAGGTGTGTCTGCTAACCAGGACATGAACGG（下游引物）；L2片段的擴增引物為CCCAAGCTCAAACCCTGGTCTCTCTGAGCC（上游引物），CCCTTCCTCTCATCACAGCTCTGAAGGACATC（下游引物）。PCR反應(yīng)體系50μl，其中10 x buffer 5μl，dNTPs（2mM each）5μl，Mg-SO4（25 mM）3μl，KOD plus 1U，上下游引物（10μM）各2μl，基因組DNA 50 ng；擴增條件為96℃預變性2 min，96℃變性30s，68℃退火加延伸6min，25次循環(huán)后，68℃延伸6min。從得到的產(chǎn)物中隨機抽取5個樣本用于測序，確定所獲得的為CYP2A13基因；第二步是進行等位基因特異擴增。按ASA-PCR原理，為每個錯義突變位點設(shè)計兩對引物，見表1。反應(yīng)體系共25μl，包括稀釋50倍的第一步產(chǎn)物 1μl，10 x buffer2.5μl，dNTPs（10 mM each）0.5μl，MgCl2（25mM）1μl，rTaq 0.5μU，上下游引物（10μM）各0.5μl；擴增條件為96℃預變性2min，96℃變性30s，退火30s（退火溫度見表2），72℃延伸1 min，循環(huán)20次后，72℃延伸5min。在第二步等位基因特異擴增反應(yīng)中，以第一步反應(yīng)中測序的5個樣品為陽性對照，同時以兩個不包含模板的反應(yīng)管為陰性對照。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，用直接計數(shù)法分析兩組中CYP2A13錯義突變位點的基因型及等位基因頻率，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，用χ2檢驗兩組之間的差異。

表2 各錯義突變位點的ASA引物

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 由于病例組中未能檢測到p.Val323Leu突變，所以無法進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。其它錯義突變位點在病例組和對照組的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（均P＞0.05），這說明樣本具有群體代表性。

2.2 兩組中錯義突變位點的分布 陽性對照的ASA實驗結(jié)果和測序結(jié)果完全一致，陰性對照未檢測到擴增條帶。對照組中p.Arg101Gln、p.Phe453Tyr、p.Arg494Cys、p. Arg101Ter和p.Val323Leu位點分別有4、3、3、3、2例樣本未能成功擴增，兩組的基因型和等位基因的分布頻率見表3。兩組中各突變位點的基因型均以野生純合型為主，突變大多以雜合型存在，突變純合型檢出極少。兩組中各突變位點的基因型和等位基因分布頻率差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表3。CYP2A13基因錯義突變與肺癌易感性可能不存在關(guān)聯(lián)。

3 討論

細胞色素p450是負責代謝外源性化學物質(zhì)的關(guān)鍵酶，包括對環(huán)境致癌物的代謝活化[8-9]，在致癌物組織原位活化及組織特異性致癌效應(yīng)起著關(guān)鍵作用。CYP2A13是一種主要表達在人的呼吸道組織的CYP亞型酶[2]。2000年，Su等[2]證明了CYP2A13可有效代謝活化煙草特異性致癌物NNK，是迄今所知的NNK代謝效率（Vmax/Km）最高的人CYP亞型酶。此外，Bao等[10-11]發(fā)現(xiàn)，致吸煙成癮的尼古丁和強致癌物質(zhì)黃曲霉素也可被CYP2A13高效地代謝激活。這些發(fā)現(xiàn)提示CYP2A13在肺癌形成中可能起到關(guān)鍵作用。

CYP2A13基因位于人的第19號染色體上，全長基因為7732 bp，由9個外顯子組成，編碼的CYP2A13蛋白的長度為494個氨基酸，分子量為55 kD[1]。目前已經(jīng)在CYP2A13外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)可引起8種錯義變異體的9個突變位點，其中p.Arg25Gln和p.Arg257Cys位點出現(xiàn)在同一個錯義變異體。由于p.Arg25Gln位點位于CYP2A13蛋白跨膜區(qū)，因此對活性影響不大[12]，本文也未對其開展研究。除p.Arg25Gln外，其它8個錯義突變位點都能導致CYP2A13酶活性的變化[13]。p.Arg101Ter提前引入了一個終止密碼子，使得肽鏈合成中斷，導致蛋白質(zhì)失去活性[4]。p.Thr134_Leu135insThr和p.Arg101Gln能降低蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，使得產(chǎn)物活性大幅度降低[12-13]。p. Arg257Cys、p.Phe453Tyr、p.Arg494Cys、p.Asp158Glu和p. Val323Leu等位點雖然不處于蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位置，但是也能降低20%～70%CYP2A13的NNK代謝效率[13]。鑒于CYP2A13在肺組織中高效表達且能有效代謝激活NNK等致癌物質(zhì)，可以推斷：導致CYP2A13酶活性降低的錯義突變可能會降低攜帶者發(fā)生肺癌的風險。目前關(guān)于CYP2A13基因多態(tài)性與肺癌的關(guān)系也有相關(guān)研究，但數(shù)量較少。雖然Wang等[14]于2003年的研究發(fā)現(xiàn)，p.Arg257Cys（導致NNK代謝活性降低50%）能顯著降低癌癥發(fā)病風險，但是CYP2A13基因錯義突變與肺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)還需要更多的研究來進一步證實。

在本研究中，我們使用ASA方法檢測了CYP2A13基因錯義突變位點在中國浙江地區(qū)漢族人中的分布，探討了CYP2A13基因錯義突變與肺癌易感性的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，在中國漢族人群中存在CYP2A13基因錯義突變，其中p.Arg257Cys、p.Arg101Ter和p.Asp158Glu突變的頻率分別是6.8%，4.0%和1.1%，和本課題組前期研究一致[15]，也與Cheng（p.Arg257Cys，n=258，5.6%）[16]、Zhang（p.Arg101Ter，n=31，3.2%；p.Asp158Glu，n=28，1.8%）[7]等的研究結(jié)果相似。與其它種族相比，p.Thr134_Leu135insThr在日本人中有較高的分布頻率（4.9%），p.Arg101Ter在日本人群中分布較低（0.3%）[6]。而 p.Arg101Ter、p. Asp158Glu和p.Val323Leu等錯義多態(tài)性位點在高斯人群[4]和中國漢族人群中的分布沒有統(tǒng)計學差異。p. Thr134_Leu135insThr、p.Arg101Ter能導致CYP2A13酶功能的缺失[12-13]，這兩個位點在中國漢族和日本人族群之間的分布差異，很可能會導致兩組人群肺癌易感性上的不同。

表3 CYP2A13基因錯義突變的分布頻率[例（%）]

本研究雖然沒有發(fā)現(xiàn)CYP2A13基因錯義突變的分布在病例組和對照組之間有統(tǒng)計學差異，可以初步認為CYP2A13基因多態(tài)性與癌癥易感性可能沒有關(guān)聯(lián)。但是，從實驗結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，雖然沒有統(tǒng)計學上的差異，但是導致的產(chǎn)物活性缺失的錯義多態(tài)性位點的分布頻率在病例組中有明顯的降低，這提示我們雖然NNK的CYP2A13代謝激活途徑在肺癌發(fā)生中起到了一定作用，但不是影響我國漢族人群肺癌發(fā)生的主要因素,可能還存在其它機制導致了個體對NNK等環(huán)境毒物易感性的差異，從而產(chǎn)生了個體肺癌易感性上的不同。例如，本課題組發(fā)現(xiàn)，NADPH-細胞色素p450氧化還原酶的突變體能增加CYP2A13的活性達10倍之多（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。雖然CYP2A13錯義多態(tài)性位點上的突變，均能降低CYP2A13的活性，但如果個體同時存在NADPH-細胞色素p450氧化還原酶突變體，則將減弱CYP2A13突變體帶來的影響。這意味著在設(shè)計和解釋CYP2A13-肺癌易感性流行病學研究時，應(yīng)該要考慮到多種因素尤其是多種代謝相關(guān)基因多態(tài)性的影響。鑒于CYP2A13與肺癌易感性之間關(guān)系的復雜性，本文的結(jié)果尚需要更大樣本的流行病學研究予以驗證。

[1]Fernandez-Salguero P，Gonzalez F J.The CYP2A gene subfamily:species differences,regulation,catalytic activities and role in chemical carcinogenesis[J].Pharmacogenetics,1995,5: 123-128.

[2]Su T,Bao Z,Zhang Q Y,et al.Human cytochrome p450 CYP2A13:predominant expression in the respiratory tract and its high efficiency metabolic activation of a tobacco-specific carcinogen,4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone[J]. Cancer Res,2000,60:5074-5079.

[3]Jalas J R,Hecht S S,and Murphy S E.Cytochrome p450 enzymes as catalysts of metabolism of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK),a tobacco-specific carcinogen [J].Chem Res Toxicol,2005,18(2):95-110.

[4]Cauffiez C,Lo-Guidice J M,Quaranta S,et al.Genetic polymorphism of the human cytochrome CYP2A13 in a French population:Implication in lung cancer susceptibility[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,317(2):662-669.

[5]Cauffiez C,Pottier N,Tournel G,et al.CYP2A13 genetic polymorphism in French Caucasian,Gabonese and Tunisian populations[J].Xenobiotica,2005,35(7):661-669.

[6]Fujieda M,Yamazaki H,Kiyotani K,et al.Eighteen novel polymorphisms of the CYP2A13 gene in Japanese[J].Drug Metab Pharmacok,2003,18(1):86-90.

[7]Zhang X,Chen Y,Liu Y,et al.Single nucleotide polymorphisms of the human CYP2A13 gene:Evidence for a null allele[J].Drug Metab Dispos,2003,31(9):1081-1085.

[8]Ortiz de Montellano P R.Cytochrome p450:structure,mechanism,and biochemistry[M].2nd ed.New York:Springer Publishing Company,1995:652-670.

[9]Rendic S.Summary of information on human CYP enzymes:human p450 metabolism data[J].Drug Metab Rev,2002,34(1-2): 383-448.

[10]Bao Z,He X Y,Ding X X,et al.Metabolism of nicotine and cotinine by human CYP2A13[J].Drug Metab Dispos,2005,33(2): 258-261.

[11]He X Y,Tang L,Wang S L,et al.Efficient activation of aflatoxin B1 by cytochrome p450 2A13,an enzyme predominantly expressed in human respiratory tract[J].Int J Cancer,2006,118 (11):2665-2671.

[12]Wang S L,He X Y,Shen J,et al.The missense genetic polymorphisms of human CYP2A13:functional significance in carcinogen activation and identification of a null allelic variant[J]. Toxicol Sci,2006,94(1):38-45.

[13]Schlicht K E,Michno N,Smith B D,et al.Functional characterization of CYP2A13 polymorphisms[J].Xenobiotica,2007,37 (12):1439-1449.

[14]Wang H,Tan W,Hao B,et al.Substantial reduction in risk of lung adenocarcinoma associated with genetic polymorphism in CYP2A13,the most active cytochrome p450 for the metabolic activation of tobacco-specific carcinogen NNK[J].Cancer Research,2003,63(22):8057-8061.

[15]Liu T,Hong Y,Li Z,et al.An investigation of the catalytic activity of CYP2A13*4 with coumarin and polymorphisms of CYP2A13 in a Chinese Han population[J].Drug Metab Dispos,2012,40 (5):847-851.

[16]Cheng X Y,Chen G L,Zhang W X,et al.p.Arg257Cys polymorphismof CYP2A13 in a Chinese population[J].Clinica Chimica Acta,2004,343(1-2):213-216.

Association between missense mutations of CYP2A13 gene and lung cancer susceptibility

ObjectiveTo investigate the association between missense mutations of CYP2A13 gene and lung cancer susceptibility.MethodsNinety one patients with lung cancer and 140 healthy subjects matched by age and sex were recruited from 2007 to 2011.Genomic DNA was isolated from peripheral blood samples,and a two-step allele-specific amplification (ASA)method was applied to genotyping.ResultsThere were no significant differences in genotype frequency of CYP2A13 missense polymorphism between cases and controls(P＞0.05):p.Arg257Cys(12.1%vs 11%),p.Thr134_Leu135insThr(2.1%vs 1.1%),p.Arg101Gln(7.3%vs 4.4%),p.Phe453Tyr(2.2%vs 1.1%),p.Arg494Cys(2.9%vs 1.1%),p.Arg101Ter(6.6%vs 2.2%), p.Asp158Glu(2.1%vs 1.1%),p.Val323Leu(0.07%vs 0%).No differences existed in the allele frequency between cases and controls(P＞0.05):p.Arg257Cys(6.8%vs 5.5%),p.Thr134_Leu135insThr(1.1%vs 0.5%),p.Arg101Gln(4.0%vs 2.2%),p. Phe453Tyr(1.1%vs 0.5%),p.Arg494Cys(1.5%vs 0.5%),p.Arg101Ter(4.0%vs 1.1%),p.Asp158Glu(1.1%vs 0.5%),p. Val323Leu(0.4%vs 0%).ConclusionThere are CYP2A13 missense polymorphisms in Chinese Han population,but these CYP2A13 missense polymorphisms might not be related to the susceptibility of lung cancer.

Lung neoplasms/Genetic Polymorphism Missense variations CYP2A13

2014-07-30）

（本文編輯：沈昱平）

國家自然科學基金（81273578）；國家科技重大專項基金（重大新藥專項課題，2012ZX09506001-004）；貴州省衛(wèi)生廳科學技術(shù)基金項目（丹參與華法林相互作用的機制研究）和貴州省科技廳貴州省科學技術(shù)基金項目（黔科合J字[2013]2034號）

550004 貴陽，貴陽醫(yī)學院藥學院貴州省藥物制劑重點實驗室（劉亭）；浙江大學藥學院藥理毒理與生化藥學研究所（李朝輝、謝章明、徐迎春、陳樞青）；浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院（吳敏良）；浙江省腫瘤醫(yī)院檢驗科（徐笑紅）

陳樞青，E-mail：chenshuqing@zju.edu.cn