張子越 殷斌 連銳銳 張璐 劉譯心 李真 孫傳熙 劉月月 楊世發(fā) 李桂明 傅劍 趙增成 黃中利 林樹(shù)乾 劉遠(yuǎn)飛 萬(wàn)仁忠

摘要 目的：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究馬齒莧活性成分緩解結(jié)腸炎的作用機(jī)制。方法：基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其活性成分和對(duì)應(yīng)靶標(biāo)，利用STRING進(jìn)行靶標(biāo)間互作分析并篩選核心靶標(biāo)，經(jīng)KEGG富集分析得到馬齒莧治療疾病的相關(guān)信號(hào)通路?；贒rugbank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取結(jié)腸炎的相關(guān)疾病靶標(biāo)，與馬齒莧成分靶標(biāo)進(jìn)行映射，得到馬齒莧治療結(jié)腸炎的作用機(jī)制。結(jié)果：共篩選獲得馬齒莧活性成分花生四烯酸、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、異甜菜素、槲皮素等10個(gè)，其對(duì)應(yīng)靶標(biāo)共187個(gè)，核心靶標(biāo)共62個(gè)，經(jīng)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)核心靶標(biāo)與癌癥、病毒感染、炎癥性腸炎和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路密切相關(guān)，并通過(guò)ABCC4、ABCG2、ACAT1、ALB、ALOX5、CYP3A4、IFNG、IKKA、MPO、NOS2、NQO1、NR1I2、PPARG、PTGS1、PTGS2、TNF、XDH起到治療結(jié)腸炎的作用。結(jié)論：馬齒莧可通過(guò)抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡發(fā)揮多靶點(diǎn)、多通路緩解結(jié)腸炎的作用。

關(guān)鍵詞 馬齒莧;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);結(jié)腸炎;作用機(jī)制

Anti-colitis Mechanism of Herba Portulacae Based on Network Pharmacology

ZHANG Ziyue1，YIN Bin2，LIAN Ruirui1，ZHANG Lu1，LIU Yixin1，LI Zhen1，SUN Chuanxi1，LIU Yueyue2，YANG Shifa2，LI Guiming2，F(xiàn)U Jian2，ZHAO Zengcheng2，HUANG Zhongli2，LIN Shuqian2，LIU Yuanfei1，WAN Renzhong1

（1 College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Agricultural University，Tai′an 271018，China; 2 New Veterinary Drug Research and Development Office，Poultry Institute，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of the active ingredients of Herba Portulacae in relieving colitis based on network pharmacology.Methods：The active ingredients and corresponding targets were obtained based on the TCMSP database，then STRING database was used to analyze the interaction among the targets and to screen the core target，which was analyzed by KEGG enrichment to obtain the signal pathway related to Herba Portulacae.Colitis-related disease targets were obtained through the Drugbank database and the targets of the ingredients of Herba Portulacae were mapped to obtain the mechanism of treating colitis by Herba Portulacae.Results：A total of 10 active ingredients such as arachidonic acid，β-sitosterol，kaempferol，luteolin，isobetain，quercetin were obtained，with 187 corresponding targets and 62 core targets.By KEGG enrichment analysis，it was found that the core targets were closely related to cancer，viral infection，inflammatory enteritis and immune regulation-related pathways，and they played a role in the treatment of colitis through targets ABCC4，ABCG2，ACAT1，ALB，ALOX5，CYP3A4，IFNG，IKKA，MPO，NOS2，NQO1，NR1I2，PPARG，PTGS1，PTGS2，TNF and XDH.Conclusion：Herba Portulacae can play a multi-target and multi-channel role in alleviating colitis through anti-inflammatory，antioxidant，and regulating cell proliferation and apoptosis.

Keywords Herba Portulacae; Network pharmacology; Colitis; Mechanism

中圖分類(lèi)號(hào)：R282;R574文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.005

馬齒莧又名馬莧、五行草、五方草、長(zhǎng)命菜、九頭獅子草，為馬齒莧科植物馬齒莧Portulaca oleracea L.的干燥地上部分，其性寒、味酸、歸大腸經(jīng)和肝經(jīng)，廣泛分布于世界各地。據(jù)《本草備要》中記載，馬齒莧主要用于散血解毒、祛風(fēng)殺蟲(chóng)，治療諸淋疳痢、血癖惡瘡、小兒丹毒和利腸滑產(chǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧中含黃酮、生物堿、脂肪酸、萜類(lèi)化合物、多糖、維生素、甾醇、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等多種成分，具有抗菌、抗病毒、抗?jié)?、抗炎、抗氧化和傷口愈合等藥理活性[1-3]。馬齒莧黃酮類(lèi)化合物，包括山柰酚，楊梅素，木犀草素，芹菜素，槲皮素等，具有抗菌，抗病毒，抗炎和抗氧化特性[4]。ω-3脂肪酸包括α-亞麻酸和亞油酸，是生長(zhǎng)和發(fā)育的必需脂肪酸，具有抗血栓形成、降血脂、降血壓和抗炎特性，馬齒莧是α-亞麻酸最豐富的來(lái)源[1]。除此，馬齒莧富含抗壞血酸，谷胱甘肽，α-生育酚和β-胡蘿卜素，具有高抗氧化特性。馬齒莧既可用做人類(lèi)和動(dòng)物食品，又可用做醫(yī)藥中的藥物，具有很高的開(kāi)發(fā)潛力。然而，由于其多成分-多靶點(diǎn)-多通路的作用方式，其對(duì)治療疾病的作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是目前研究中藥全面而有效的工具，提供了一種“多靶點(diǎn)，多藥效，復(fù)雜疾病”的網(wǎng)絡(luò)模型，從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)引入中藥研究領(lǐng)域，成為探究中藥作用機(jī)制與促進(jìn)中藥發(fā)展的重大契機(jī)。Xu等[6]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)找到元胡止痛片的活性成分及作用靶標(biāo)，并發(fā)現(xiàn)其還具有抗焦慮、抗抑郁的活性，指出藥物的新功效;李翔等[7]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)丹參復(fù)方的9個(gè)活性成分及相關(guān)作用靶點(diǎn);黃明峰等[8]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)，得用于治療冠心病的中藥與西藥的138個(gè)共同靶標(biāo)，以及397個(gè)的中藥獨(dú)特作用靶標(biāo)，提出中藥治療冠心病確實(shí)存在獨(dú)特的作用機(jī)制。Gao等[9]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)逍遙散中具有良好藥代動(dòng)力學(xué)特征的活性化合物66種，并與40種抑郁相關(guān)的蛋白質(zhì)相關(guān)，特別是HTR2A、NR3C1、XDH和CNR2。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過(guò)ADME分析篩選出馬齒莧的活性成分，并找到其對(duì)應(yīng)的作用靶標(biāo)，利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶標(biāo)間的互作網(wǎng)絡(luò)，篩選得到馬齒莧作用的核心靶標(biāo)，并對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析，探究馬齒莧治療疾病的作用及機(jī)制，為該藥的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 資料來(lái)源

通過(guò)中醫(yī)百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（ETCM，http：//www.ehbio.com/ETCM/），在中藥板塊檢索馬齒莧，獲得含馬齒莧的方劑及主治。

藥物在機(jī)體內(nèi)需要經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝和排泄（ADME）的過(guò)程，才能到達(dá)靶器官發(fā)揮藥理活性?？诜枚龋∣B）、成藥性（DL）和半衰期（HL）是評(píng)價(jià)中藥成分ADME過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)。本研究通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu/cn/tcmsp.php），檢索全部與馬齒莧相關(guān)的化學(xué)成分，并以O(shè)B、DL、HL為篩選參數(shù)，獲取同時(shí)滿足OB≥30%、DL≥0.18和HL≥4 h的化學(xué)成分作為馬齒莧的潛在活性成分。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu/cn/tcmsp.php），獲取馬齒莧活性成分的相關(guān)靶標(biāo)，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）對(duì)獲得的所有相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，獲取其對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱(chēng)。將馬齒莧活性成分-靶標(biāo)及數(shù)據(jù)屬性表格導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建馬齒莧活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 成分靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將獲得的基因簡(jiǎn)稱(chēng)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/cgi/input.pl），獲得各靶標(biāo)間的相互作用關(guān)系，篩選得分≥0.7的相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建靶標(biāo)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。其中自由度（Degree）表示在相互作用網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)數(shù)目，利用Cytoscape軟件中的網(wǎng)絡(luò)分析功能“generate style from statistics”設(shè)置靶標(biāo)大小反映自由度值。

1.2.3 核心靶標(biāo)的篩選

通過(guò)Cytoscape軟件中的網(wǎng)絡(luò)分析功能，獲得馬齒莧活性成分相關(guān)靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋮?shù)：自由度、介數(shù)、接近中心性和平均最短路徑長(zhǎng)度。篩選出自由度、介數(shù)、接近中心性均大于或等于中位數(shù)，而平均最短路徑長(zhǎng)度小于或等于中位數(shù)的靶標(biāo)，作為核心靶標(biāo)。

1.2.4 核心靶標(biāo)信號(hào)通路富集分析

將核心靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），將物種和基因背景設(shè)置為人，進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，以探究馬齒莧治療疾病的主要代謝通路，并利用R語(yǔ)言繪制主要代謝通路氣泡圖。

1.2.5 馬齒莧緩解結(jié)腸炎的作用機(jī)制分析

通過(guò)Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/），收集與結(jié)腸炎（Colitis）相關(guān)的靶標(biāo)，分別記錄與輕度潰瘍性結(jié)腸炎（Mild Ulcerative Colitis）、中度潰瘍性結(jié)腸炎（Moderate Ulcerative colitis）、嚴(yán)重潰瘍性結(jié)腸炎（Severe Ulcerative Colitis）、潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis）、痙攣性結(jié)腸炎（Spastic Colitis）、巨細(xì)胞病毒性結(jié)腸炎（Cytomegalovirus Colitis），和因服用免疫抑制類(lèi)藥物導(dǎo)致的結(jié)腸炎相關(guān)的靶標(biāo)。取所有靶標(biāo)的合集，并去除相互重疊的靶標(biāo)，即為構(gòu)建的結(jié)腸炎相關(guān)靶標(biāo)集。將該靶標(biāo)集與馬齒莧活性成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)進(jìn)行匹配，獲得馬齒筧緩解結(jié)腸炎損傷的作用靶標(biāo)，并將該作用靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析。

2 結(jié)果

2.1 含馬齒莧方劑及主治分析 通過(guò)ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得含馬齒莧的方劑15個(gè)，其方劑名稱(chēng)、治療綜合征和適應(yīng)證見(jiàn)表1。由表1可以看出馬齒莧具有治療胃腸濕熱引起的腹瀉和痢疾的功效。

2.2 馬齒莧活性成分的篩選

依托TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到馬齒莧中的54個(gè)化學(xué)成分，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18和HL≥4 h篩選出10個(gè)化學(xué)成分，分別為花生四烯酸、環(huán)木菠蘿烯酸、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、異甜菜素、異甜菜甙和槲皮素，作為馬齒莧的活性成分，其編號(hào)及其ADME關(guān)鍵參數(shù)見(jiàn)表2。

2.3 馬齒莧活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選馬齒莧活性成分的靶標(biāo)，獲得花生四烯酸對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)33個(gè)、環(huán)木菠蘿烯酸對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)1個(gè)、β-胡蘿卜素對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)22個(gè)、β-谷甾醇對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)10個(gè)、山柰酚對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)40個(gè)、5，7-dihydroxy-2-（3-hydroxy-4-methoxyphenyl）chroman-4-one對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)9個(gè)、木犀草素對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)50個(gè)、異甜菜素對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)8個(gè)、異甜菜苷對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)3個(gè)、槲皮素對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)130個(gè)。收集所有活性成分的靶標(biāo)，并通過(guò)Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶標(biāo)的基因簡(jiǎn)稱(chēng)，去除重復(fù)靶標(biāo)，共獲得馬齒莧活性成分的作用靶標(biāo)187個(gè)。見(jiàn)表3。將馬齒莧活性成分和對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制馬齒莧活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖1。其中，黃色箭頭狀代表馬齒莧的活性成分，紅色六邊形代表活性成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)。其中自由度為2的靶標(biāo)有52個(gè);自由度為3的靶標(biāo)有15個(gè)，分別為花生四烯酸5-脂氧化酶（Arachidonate 5-lipoxygenase）ALOX5、G1/S特異性細(xì)胞周期蛋白D1（G1/S-specific Cyclin-D1）CCND1、絲裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated Protein Kinase 1）MAPK1、半胱天冬酶-8（Caspase-8）CASP8、細(xì)胞色素P450 1A2（Cytochrome P450 1A2）CYP1A2、細(xì)胞色素P450 3A4（Cytochrome P450 3A4）CYP3A4、72 kDa IV型膠原酶（72 kDa type IV Collagenase）MMP2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（Vascular Endothelial Growth Factor A，VEGFA）、凋亡調(diào)控因子BAX（Apoptosis Regulator BAX，BAX）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P（Glutathione S-transferase P1，GSTP1）、胰島素受體（Insulin Receptor，INSR）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4增強(qiáng)因子（Solute Carrier Family 2，F(xiàn)acilitated Glucose Transporter Member 4，SLC2A4）、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（Xanthine Dehydrogenase/Oxidase，XDH）、雄激素受體（Androgen Receptor，AR）;自由度為4的靶標(biāo)有7個(gè)，分別為過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體γ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma，PPAR-γ）、轉(zhuǎn)錄因子p65（Transcription Factor p65）RELA、凋亡調(diào)控因子Bcl-2（Apoptosis Regulator Bcl-2）Bcl-2、半胱天冬酶-9（Caspase-9）CASP9、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha Serine/Threonine-protein Kinase）AKT1、血紅素氧合酶1（Heme Oxygenase 1，HMOX1）、間質(zhì)膠原酶（Interstitial Collagenase）MMP1;自由度為5的靶標(biāo)有1個(gè)，為轉(zhuǎn)錄因子AP-1（Transcription Factor AP-1）JUN;自由度為6的靶標(biāo)有1個(gè)，為半胱天冬酶-3（Caspase-3）CASP3;自由度為8的靶標(biāo)有1個(gè)，為前列腺素G/H合酶2（Prostaglandin G/H synthase 2）PTGS2。

2.4 成分靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將獲得的187個(gè)馬齒莧活性成分作用靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，可獲得3 519條作用關(guān)系，評(píng)分均≥0.4，篩選出評(píng)分≥0.7的相互作用關(guān)系有1 358條。將1 358條相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件，根據(jù)靶標(biāo)自由度的大小設(shè)置靶標(biāo)大小，構(gòu)建馬齒莧作用靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2。通過(guò)Cytoscape軟件中的網(wǎng)絡(luò)分析功能，獲得該相互作用網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋮?shù)，篩選出自由度、介數(shù)、接近中心性均大于或等于中位數(shù)，而平均最短路徑長(zhǎng)度小于或等于中位數(shù)的靶標(biāo)，作為核心靶標(biāo)。見(jiàn)表4。其中自由度較高的前10個(gè)靶標(biāo)有AKT1（70）、TP53（69）、IL6（59）、MAPK1（59）、TNF（58）、VEGFA（56）、MAPK8（55）、JUN（50）、MYC（47）、EGF（46）;介數(shù)較高的前10個(gè)靶標(biāo)有TP53（0.128 7）、AKT1（0.082 8）、MAPK1（0.064 6）、IL6（0.048 4）、VEGFA（0.045 0）、APP（0.040 6）、TNF（0.039 8）、HSP90AA1（0.038 4）、MYC（0.034 0）、PPARG（0.033 2）;接近中心性較高的前10個(gè)靶標(biāo)有TP53（0.603 7）、AKT1（0.590 6）、IL6（0.582 1）、VEGFA（0.578 0）、MAPK1（0.571 9）、TNF（0.562 1）、MAPK8（0.558 2）、JUN（0.550 7）、EGF（0.545 2）、MYC（0.539 7）;平均最短路徑較低的前10個(gè)靶標(biāo)有TP53（1.656 4）、AKT1（1.693 3）、IL6（1.717 8）、VEGFA（1.730 1）、MAPK1（1.748 5）、TNF（1.779 1）、MAPK8（1.791 4）、JUN（1.816 0）、EGF（1.834 4）、MYC（1.852 8）。

2.5 核心靶標(biāo)信號(hào)通路富集分析

將獲得的62個(gè)核心靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），將物種和基因背景設(shè)置為人，進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，按照P值進(jìn)行排序，前30個(gè)信號(hào)通路的具體信息和相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)見(jiàn)表5，運(yùn)用R語(yǔ)言制備KEGG信號(hào)通路富集氣泡圖見(jiàn)圖3，其中圓圈大小表示富集在該通路上的靶標(biāo)個(gè)數(shù)，圓越大說(shuō)明富集在通路上的靶標(biāo)個(gè)數(shù)越多;圓圈顏色表示靶標(biāo)富集在通路上的P值，P值越小說(shuō)明富集在該信號(hào)通路越可靠。由KEGG富集分析可以看出，馬齒莧作用核心靶標(biāo)與結(jié)直腸癌、瘧疾、炎癥性腸病信號(hào)通路相關(guān)，與馬齒莧治療腹瀉疾病具有良好效果相一致;與癌癥通路（膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、癌癥中蛋白聚糖通路、結(jié)直腸癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、p53信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路）相關(guān)，推測(cè)馬齒莧具有一定的抗癌效果;與病毒性疾?。ㄒ倚透窝?、甲型流感、T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型感染、單純皰疹感染、結(jié)核、丙型肝炎）相關(guān)，推測(cè)馬齒莧具有一定的抗病毒效果;與免疫相關(guān)信號(hào)通路（NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路），推測(cè)馬齒莧可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。

2.6 馬齒莧緩解結(jié)腸炎的作用機(jī)制

通過(guò)Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/），共檢索到與輕度潰瘍性結(jié)腸炎（Mild Ulcerative Colitis）相關(guān)的靶標(biāo)共17個(gè)，與中度潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的靶標(biāo)共20個(gè)，與嚴(yán)重潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的靶標(biāo)共37個(gè)，與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的靶標(biāo)共60個(gè)，與痙攣性結(jié)腸炎相關(guān)的靶標(biāo)共4個(gè)，與巨細(xì)胞病毒性結(jié)腸炎相關(guān)的靶標(biāo)共9個(gè)，與因服用免疫抑制類(lèi)藥物導(dǎo)致的結(jié)腸炎相關(guān)的靶標(biāo)共1個(gè)，去除相互重疊的靶標(biāo)共得到91個(gè)。與馬齒莧活性成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)進(jìn)行匹配，共篩選出馬齒莧緩解結(jié)腸炎損傷的作用靶標(biāo)共17個(gè)，分別為ABCC4、ABCG2、ACAT1、ALB、ALOX5、CYP3A4、IFNG、IKKA、MPO、NOS2、NQO1、NR1I2、PPARG、PTGS1、PTGS2、TNF、XDH。見(jiàn)表5。對(duì)獲取的馬齒莧緩解結(jié)腸炎的17個(gè)作用靶標(biāo)進(jìn)行GO分析，見(jiàn)圖4，發(fā)現(xiàn)其與正調(diào)控平滑肌細(xì)胞的增殖、負(fù)調(diào)控氧化應(yīng)激與抗炎功能有關(guān)。

3 討論

馬齒莧又名馬莧、五行草、五方草、長(zhǎng)命菜、九頭獅子草，為馬齒莧科植物馬齒莧Portulaca oleracea L.的干燥地上部分，主要用于散血解毒、祛風(fēng)殺蟲(chóng)，治療諸淋疳痢、血癖惡瘡、小兒丹毒和利腸滑產(chǎn)。中藥作為重要的藥物開(kāi)發(fā)資源庫(kù)，用于抗病毒、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力越來(lái)越受到人們的重視[10]。依托TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)ADME參數(shù)共篩選出10個(gè)化學(xué)成分：花生四烯酸、環(huán)木菠蘿烯酸、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、異甜菜素、異甜菜苷和槲皮素，作為其發(fā)揮藥效的可能活性成分。基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選馬齒莧活性成分的作用靶標(biāo)，通過(guò)STRING進(jìn)行靶標(biāo)間的互作分析，并利用Cytoscape構(gòu)建靶標(biāo)間互作網(wǎng)絡(luò)，以自由度、介數(shù)、接近中心性和最短路徑長(zhǎng)度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，共篩選出核心靶標(biāo)62個(gè)。通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)量進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)：核心靶標(biāo)與癌癥通路、免疫相關(guān)通路、病毒性疾病和腹瀉相關(guān)疾病有密切關(guān)系。

P53是一種腫瘤抑制基因，其表達(dá)與失活對(duì)腫瘤的形成起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，MDM2-P53-P21WAFI/CIPI信號(hào)通路是P53基因通路中的重要通路之一，該通路中的任何一個(gè)基因的結(jié)構(gòu)或功能的改變和異常都可能對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[11]。MDM2與P53之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)的相互作用，而諸多可能因素造成二者之間相互關(guān)系的失衡可直接導(dǎo)致P53的失活進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生[12]。P21WAFI/CIPI基因是P53基因最重要的下游之一，其啟動(dòng)子上游包含有P53蛋白的識(shí)別序列，可與P53蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，進(jìn)一步通過(guò)此途徑調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞活動(dòng)，發(fā)揮相應(yīng)作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)P53是馬齒莧成分木犀草素和槲皮素的共同作用靶標(biāo)，并且是馬齒莧發(fā)揮作用的核心靶標(biāo)，MDM2也是馬齒莧成分木犀草素的作用靶標(biāo)，由此可以推測(cè)，馬齒莧發(fā)揮抗癌癥/抗腫瘤的作用機(jī)制與P53相關(guān)信號(hào)通路有著密切的關(guān)系。

馬齒莧作用核心靶標(biāo)AKT1、IL6、TNF、MAPK1、MAPK8、JUN、MYC、EGF與病毒侵染密切相關(guān)。MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，PI3K-Akt信號(hào)通路在調(diào)控各種不同細(xì)胞功能（包括代謝、生長(zhǎng)、增殖、成活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成）方面發(fā)揮重要作用，二者在病毒入侵過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，病毒對(duì)機(jī)體的侵染可通過(guò)宿主細(xì)胞的內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)，而這個(gè)過(guò)程正是通過(guò)激活并利用宿主的PI3K-AKT信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，采用PI3K-AKT通路的活性抑制基可以顯著減少病毒的入侵[14]，并發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT通路的活性抑制通過(guò)抑制病毒早期和晚期相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮作用[15-17]，最終導(dǎo)致了病毒量的減少;也有研究表明在病毒的感染早期，通過(guò)激活PI3K-AKT相關(guān)信號(hào)通路，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制Caspase-3的激活，進(jìn)而促進(jìn)宿主細(xì)胞的成活來(lái)達(dá)到病毒增殖的目的，有助于維持病毒的潛伏感染狀態(tài)[18-19]。結(jié)合PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行推測(cè)，馬齒莧的相關(guān)活性成分可能可以通過(guò)抑制PI3K的磷酸化和PDK的活化來(lái)抑制AKT信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮抗病毒作用。

炎癥性腸病是導(dǎo)致機(jī)體腹瀉的重要疾病，本研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧核心成分與該疾病信號(hào)通路相關(guān)，通過(guò)靶標(biāo)IL2、IL4、IL6、IL10、TNF、RELA、JUN、IFNG、IL1B、STAT1、TGFB1發(fā)揮作用。該治療作用與《本草綱目》等古籍中記載，我國(guó)民間常使用馬齒莧煎水喝來(lái)治療急性腸炎、痢疾、腹瀉等相一致[20]。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)馬齒莧可以對(duì)某些腸道性疾病有很好的預(yù)防和治療作用，如IBD、IBS和潰瘍性結(jié)腸炎，這與本課題組的前期研究結(jié)果保持一致?，F(xiàn)代藥理學(xué)也證實(shí)馬齒莧及其某些單體成分對(duì)腸道炎性反應(yīng)具有一定的保護(hù)作用[21-23]。本研究結(jié)果顯示篩選出的10種活性成分均可在不同類(lèi)型的腸道炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用，其中AKT1、TP53、MAPK1、IL6、TNF等是馬齒莧緩解腸道炎性反應(yīng)的主要作用靶點(diǎn)，馬齒莧中的活性成分可直接作用于AKT1、MAPK1等發(fā)揮作用，也可間接作用于其他靶點(diǎn)發(fā)揮作用。MAPK1在由胞外刺激如炎性反應(yīng)遞質(zhì)、應(yīng)激、物理刺激等胞外刺激所引起的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起重要的作用，能夠引起廣泛的蛋白質(zhì)磷酸化，這些磷酸化的蛋白質(zhì)又各自具有許多的底物，能夠引起進(jìn)一步的反應(yīng)，如導(dǎo)致TNF-α等炎性反應(yīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)還可引起與炎性反應(yīng)相關(guān)的一些重要酶的激活[24]。一些常見(jiàn)的炎性反應(yīng)遞質(zhì)如TNF-α、IL-6、IL-1β是許多炎性反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)因子。由此可以推測(cè)馬齒莧中的抗炎成分可以通過(guò)抑制MAPK進(jìn)而使TNF-α等炎性反應(yīng)遞質(zhì)釋放減少，從而達(dá)到抗炎的作用[25]。AKT1（蛋白激酶）、P53均可參與包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的細(xì)胞代謝過(guò)程，因此可以推測(cè)馬齒莧中的活性成分通過(guò)與AKT1和P53相互作用延緩甚至阻斷了細(xì)胞的凋亡從而發(fā)揮抗炎作用。

另外，馬齒莧鮮品和不同提取方法得到的馬齒莧提取物都對(duì)志賀菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌等具有一定的抑制作用[26-27]。利用構(gòu)建的不同濃度下LPS誘導(dǎo)RIMVECs和IEC-6細(xì)胞損傷的模型，卞藝斐[23]研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧水提液可以通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性反應(yīng)遞質(zhì)和TLR4/核因子-κB通路的蛋白表達(dá)起到抗炎的作用;此外，其活性成分槲皮素和山萘酚也能夠?qū)PS誘導(dǎo)的RIMVECs中TLR4/核因子-κB/MAPK/STAT通路蛋白的表達(dá)起到抑制作用。馬齒莧活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果顯示，馬齒莧活性成分的187個(gè)作用靶標(biāo)中，部分對(duì)應(yīng)MAPK信號(hào)通路和重要炎性反應(yīng)遞質(zhì)如TNF、IL-1β、IL-4、IL-6等，提示馬齒莧可能在炎性反應(yīng)中起到了一定的作用，這一點(diǎn)在相關(guān)研究中得到了證實(shí)[28-29];靶標(biāo)構(gòu)建結(jié)果還表明馬齒莧活性成分可對(duì)應(yīng)某些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因如Caspase7、Caspase3、Caspase9等，表明馬齒莧的活性成分還可能通過(guò)調(diào)控凋亡基因的表達(dá)對(duì)發(fā)生炎性反應(yīng)的細(xì)胞或組織等起到一定的保護(hù)作用，這與相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧對(duì)凋亡基因的一定調(diào)控作用相一致[30]。

綜上所述，本研究通過(guò)應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析技術(shù)，對(duì)馬齒莧的主要活性成分、成分靶標(biāo)互作、核心靶標(biāo)信號(hào)通路進(jìn)行研究分析，得到包含花生四稀酸、環(huán)木菠蘿烯酸、β-胡蘿卜素在內(nèi)的10種馬齒莧的主要活性成分，還富集到了包括炎性反應(yīng)相關(guān)、抗病毒相關(guān)、癌癥相關(guān)的多種信號(hào)通路。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，得到的這10種馬齒莧的活性成分既能夠通過(guò)相應(yīng)的通路起到抗炎、抗病毒作用;同時(shí)也能夠間接調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、凋亡等活動(dòng)，從而達(dá)到抗腫瘤的效果。本研究成果為后續(xù)馬齒莧作用機(jī)制的理論研究和實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供了重要的理論依據(jù)，同時(shí)也為更合理、更好地開(kāi)發(fā)利用馬齒莧提供了思路。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhou YX，Xin HL，Rahman K，et al.Portulaca oleracea L.：a review of phytochemistry and pharmacological effects[J].Biomed Res Int，2015，2015：925631.

[2]Iranshahy M，Javadi B，Iranshahi M，et al.A review of traditional uses，phytochemistry and pharmacology of Portulaca oleracea L[J].J Ethnopharmacol，2017，205：158-172.

[3]Xiang L，Xing D，Wang W，et al.Alkaloids from Portulaca oleracea L[J].Phytochemistry，2005，66（21）：2595-2601.

[4]Guo G，Yue L，F(xiàn)an S，et al.Antioxidant and Antiproliferative Activities of Purslane Seed Oil[J].J Hypertens（Los Angel），2016，5（2）：218.

[5]Li S，Zhang B.Traditional Chinese medicine network pharmacology：theory，methodology and application[J].Chin J Nat Med，2013，11（2）：110-120.

[6]Xu H，Tao Y，Lu P，et al.A computational drug-target network for yuanhu zhitong prescription[J].Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：658531.

[7]李翔，吳磊宏，范驍輝，等.復(fù)方丹參方主要活性成分網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（21）：2911-2915.

[8]黃明峰，張燕玲，任真真，等.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討活血化瘀中藥治療冠心病作用機(jī)理[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14（5）：1969-1975.

[9]GaoY，Gao L，Tian JS，et al.A Network Pharmacology Approach to Decipher the Mechanisms of Anti-depression of Xiaoyaosan Formula[J].WJTCM，2018，4（4）：147.

[10]王憲英，王曉麗，李雪靖，等.中藥配方顆粒的藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)評(píng)價(jià)研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2019，14（4）：119-123.

[11]Vogelstein B，Lane D，Levine AJ.Surfing the p53 network[J].Nature，2000，408（6810）：307-310.

[12]Watanabe T，Ichikawa A，Saito H，et al.Overexpression of the MDM2 oncogene in leukemia and lymphoma[J].Leuk Lymphoma，1996，21（5-6）：391-397，color plates XVI following 5.

[13]Gartel A L，Tyner AL.Transcriptional regulation of the p21（WAF1/CIP1）gene[J].Exp Cell Res，1999，246（2）：280-289.

[14]Ehrhardt C，Marjuki H，Wolff T，et al.Bivalent role of the phosphatidylinositol-3-kinase（PI3K）during influenza virus infection and host cell defence[J].Cell Microbiol，2006，8（8）：1336-1348.

[15]de Freitas MH，de Oliveira LC，Mügge FL，et al.The interplay between Araatuba virus and host signaling pathways：role of PI3K/Akt in viral replication[J].Arch Virol，2011，156（10）：1775-1785.

[16]Johnson RA，Wang X，Ma XL，et al.Human cytomegalovirus up-regulates the phosphatidylinositol 3-kinase（PI3-K）pathway：inhibition of PI3-K activity inhibits viral replication and virus-induced signaling[J].J Virol，2001，75（13）：6022-6032.

[17]Soares JA，Leite FG，Andrade LG，et al.Activation of the PI3K/Akt pathway early during vaccinia and cowpox virus infections is required for both host survival and viral replication[J].J Virol，2009，83（13）：6883-6899.

[18]Zhang HM，Yuan J，Cheung P，et al.Overexpression of interferon-gamma-inducible GTPase inhibits coxsackievirus B3-induced apoptosis through the activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway and inhibition of viral replication[J].J Biol Chem，2003，278（35）：33011-33019.

[19]Liu Z，Zhang H M，Yuan J，et al.Focal adhesion kinase mediates the interferon-gamma-inducible GTPase-induced phosphatidylinositol 3-kinase/Akt survival pathway and further initiates a positive feedback loop of NF-kappaB activation[J].Cell Microbiol，2008，10（9）：1787-800.

[20]王慶國(guó).本草綱目（金陵本）新校注[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2013：37.

[21]王國(guó)玉，王浩宇，佟繼銘.馬齒莧的化學(xué)成分與藥理作用研究現(xiàn)狀[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，29（1）：82-85.

[22]代月，韓振忠，楊春佳，等.馬齒莧多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜sIgA及病理表現(xiàn)的影響[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2016，28（8）：903-905，915.

[23]卞藝斐.馬齒莧對(duì)實(shí)驗(yàn)性腸炎大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[24]Kim DK，Lim JH，Lee JA，et al.Synthesis and biological evaluation of trisubstituted imidazole derivatives as inhibitors of p38alpha mitogen-activated protein kinase[J].Bioorg Med Chem Lett，2008，18（14）：4006-4010.

[25]劉鈺.基于NEI網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)研究四妙君逸軟膏止痛—促愈—抗炎的作用機(jī)制[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[26]張秀娟，季宇彬，曲中原，等.馬齒莧體外抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2002，14（5）：277-280.

[27]趙旭功，吳經(jīng)緯，張西榮，等.馬齒莧的藥理研究及臨床應(yīng)用[J].山東醫(yī)藥工業(yè)，2002，21（4）：34-36.

[28]Kim KH，Park EJ，Jang H J，et al.1-Carbomethoxy-β-Carboline，Derived from Portulaca oleracea L.，Ameliorates LPS-Mediated Inflammatory Response Associated with MAPK Signaling and Nuclear Translocation of NF-κB[J].Molecules，2019，24（22）：4042.

[29]Miao L，Tao H，Peng Y，et al.The anti-inflammatory potential of Portulaca oleracea L.（purslane）extract by partial suppression on NF-κB and MAPK activation[J].Food Chem，2019，290：239-245.

[30]Kong R，Luo H，Wang N，et al.Portulaca Extract Attenuates Development of Dextran Sulfate Sodium Induced Colitis in Mice through Activation of PPARγ[J].PPAR Res，2018，2018：6079101.

（2019-12-23收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2019MC022）;家禽研究所學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（CXGC2018E11）;山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題基金項(xiàng)目（SDPDI201809）作者簡(jiǎn)介：張子越（1996.02—），女，碩士研究生在讀，研究方向：藥理學(xué)與毒理學(xué)，E-mail：673873609@qq.com通信作者：林樹(shù)乾（1979.02—），男，博士研究生，副研究員，研究方向：新獸藥研發(fā)，E-mail：shuqianlin@126.com;劉遠(yuǎn)飛（1971.10—），男，博士研究生，講師，研究方向：細(xì)菌耐藥性，E-mail：lyuanfei@sdau.edu.cn;萬(wàn)仁忠（1967.12—），男，博士研究生，教授，研究方向：藥理學(xué)與毒理學(xué)，E-mail：wrzh63@163.com