范吉林 朱婷婷 薛振宇 任雯慶 郭經(jīng)奇 張世亮

摘要 目的：利用網(wǎng)絡藥理學的方法探討丹參-紅花藥對治療冠心病的作用機制。方法：運用TCMSP網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫對丹參-紅花兩味藥主要有效成分及作用靶點進行篩選和挖掘，利用Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建中藥成分-靶點網(wǎng)絡圖;以O(shè)MIM在線分析平臺挖掘冠心病的相關(guān)作用靶點，基于STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建丹參-紅花治療CHD的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖，然后進行拓撲分析，篩選出丹參-紅花治療冠心病的核心靶點。利用Metascape數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病交集靶點進行生物通路及富集分析。結(jié)果：丹參-紅花成分-靶點網(wǎng)絡圖包含87個有效成分，相對應靶點1 693個;核心靶點涉及TNF、白細胞介素-1B（IL-1B）、髓過氧化物酶（MPO）、血管細胞黏附蛋白1（VCAM1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）等。結(jié)論：丹參-紅花治療冠心病主要靶點參與與流體剪切應力與動脈粥樣硬化、活性氧代謝過程、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、蛋白質(zhì)復合物裝配的正調(diào)控、細胞活化的調(diào)節(jié)等相關(guān)，其中聚集在流體剪切應力與動脈粥樣硬化的靶點最多。

關(guān)鍵詞 丹參-紅花;網(wǎng)絡藥理學;冠心病;作用機制

Study on the Mechanism of Herb Pair Radix Salviae Miltiorrhizae-Flos Carthami in Treating Coronary Heart Disease Based on the Network Pharmacology

FAN Jilin 1，ZHU Tingting2，XUE Zhenyu1，REN Wenqing1，GUO Jingqi1，ZHANG Shiliang3

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China; 2 Department of Neurosurgery，Affiliated Hospital of Binzhou Medical College，Binzhou 256600，China; 3 Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China）

Abstract Objective：To explore and analyze the mechanism of Radix Salviae Miltiorrhizae-Flos Carthami herb pair on the treating coronary heart disease through network pharmacology.Methods：The TCMSP network database was used to screen and mine the main effective components and targets of Danshen-Honghua，and the Cytoscape3.7.2 software was used to construct the network diagram of traditional Chinese medicine components and targets.The OMIM online analysis platform was used to mine the relevant targets of coronary heart disease.Based on STRING database，the protein-protein interaction （PPI） network diagram （PPI） of Danshen-Honghua for CHD treatment was constructed.Then topological analysis was performed to screen out the core targets of Danshen-Honghua for CHD treatment.Metascape database was used to analyze the biological pathway and enrichment of drug-disease intersection targets.Results：The network diagram of Danshen-Honghua and target contains 87 active components and 1693 corresponding targets.The core targets include TNF，1L1B，MPO，VCAM1，VEGFR，MMP3，etc.Conclusion：It can be seen that the main target participation of Danshen-Honghua in treating coronary heart disease is related to fluid shear stress and atherosclerosis，active oxygen metabolism process，positive regulation of DNA binding transcription factor activity，positive regulation of protein complex assembly，regulation of cell activation，etc.Among them，the largest amount of targets were concentrated in fluid shear stress and atherosclerosis，which further illustrated that Danshen-Honghua had more pathways and more complicated mechanisms in treating coronary heart disease，and also suggested that this biological process might be an important direction for future research on Danshen-Honghua in treating CHD.

Keywords Danshen-Honghua; Network Pharmacology; Coronary heart disease; Mechanism

中圖分類號：R285;R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.004

冠心病（Coronary Heart Disease，CHD）是一種常見的心血管疾病，好發(fā)于老年人，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，患病率呈逐年上升的趨勢[1]。中醫(yī)將CHD歸于“胸痹”范疇，其病位在心，可涉及肝、脾、腎等臟腑，病理因素可有寒凝、痰濁、血瘀等[2]，基本病機為寒凝心脈、飲食不節(jié)、脾胃虛弱、痰濁互結(jié)，日久可導致瘀血阻滯，發(fā)展為胸痹[3]。心血管疾病是導致老年人死亡的一個重要的危險因素，CHD是其中的一個重要原因，且我國CHD患病的人數(shù)每年以20%的速度增長，CHD病死率占所有心臟疾病死亡人數(shù)的10%～20%[4]。目前在臨床中大多采用西藥治療，容易產(chǎn)生耐藥性和一定的不良反應，而中藥通過多通路、多靶點等角度治療疾病，在臨床中取得了較為可觀的療效[5]。

在臨床中，丹參和紅花配伍在臨床中常用于CHD的治療，其中丹參能夠活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰;紅花可以活血通經(jīng)，散瘀止痛?，F(xiàn)代研究表明丹參中的有效成分具有增強心肌收縮力、調(diào)節(jié)心臟功能，平衡心肌耗氧量;擴張冠狀動脈，增加血流量;阻礙血小板聚集、抗血栓形成等作用[6];紅花中的有效成分抗凝、保護心肌、穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外鈣離子等作用[7]。

網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)藥理學，在分子水平上構(gòu)建“藥物-成分-疾病”的靶點網(wǎng)絡圖。其采用的系統(tǒng)生物學研究思路正好與中藥多成分、多途徑、多靶點的整體系統(tǒng)調(diào)控相一致，而且其整體性與系統(tǒng)性與中醫(yī)藥研究的整體觀與辨證論治相契合[8-9]。近年來國內(nèi)外眾多學者利用網(wǎng)絡藥理學對中藥復方、單味藥及藥對慢性心力衰竭、CHD、糖尿病等多種疾病作用進行了研究[10-12]，實踐證明該方法對中藥的成分、作用靶點及通路的篩選具有重要的意義。本研究利用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫對丹參-紅花治療CHD的作用機制進行研究，為丹參-紅花在臨床上治療CHD提供思路和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 丹參、紅花藥對活性成分的獲取與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medi-cine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php）中分別錄入丹參、紅花進行檢索，按口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性DL≥0.18條件篩選出有效成分，通過該數(shù)據(jù)庫導出所選活性成分對應的靶點。然后將導出的靶點導入Unitprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.unitprot.org/），進行基因的標準化處理。

1.2 CHD疾病靶點的獲取與預測

在OMIM（http：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫中以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞進行檢索，將檢索到的蛋白名稱復制到Uniprot數(shù)據(jù)庫中進行基因的標準化處理，得到疾病相關(guān)的靶點信息。通過OMIM數(shù)據(jù)庫篩選的與CHD相關(guān)的靶點有190個。將這些基因?qū)隒ytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“疾病-靶點”網(wǎng)絡圖。

1.3 丹參-紅花活性成分網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將丹參、紅花的活性成分導入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建其活性成分的靶點網(wǎng)絡圖，并進行網(wǎng)絡拓撲分析。在網(wǎng)絡中，節(jié)點代表化合物信息，邊代表活性成分-靶點的相互作用。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖的構(gòu)建與分析

先將丹參、紅花的有效成分作用靶點進行去重，再與CHD疾病靶點組建“成分-靶點”數(shù)據(jù)庫，取兩者交集，組成“成分-靶點”映射文件，即尋找成分與疾病共有的靶點，將共有靶點與化合物成分輸入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，構(gòu)建“丹參、紅花-CHD靶點”的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖。利用Cytoscape3.7.2軟件中的Network Analyzer進行分析，根據(jù)節(jié)點度（Degree≥8）值進行篩選，得到丹參-紅花治療CHD的核心作用靶點。

1.5 生物通路及富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫對丹參-紅花治療CHD的共有作用靶點進行分析。將上述共有靶點導入Metascape，物種設(shè)置為人，進行分析，通過通路富集結(jié)果對丹參-紅花治療CHD的作用機制進行預測。

2 結(jié)果

2.1 丹參-紅花藥對活性成分的靶點篩選及預測

通過TCMSP檢索獲得丹參有效成分65個，紅花有效成分22個，丹參-紅花的具體活性成分見表1。

2.2 丹參-紅花成分靶點的預測及成分-靶點網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡圖，網(wǎng)絡圖中共有234節(jié)點組成，“矩形”矩形代表中藥丹參和紅花，“V”形代表丹參-紅花中有效成分共84節(jié)點，菱形代表有效成分所對應的靶點共150節(jié)點，節(jié)點與節(jié)點之間的邊表示藥物成分與靶點之間的相互作用關(guān)系，最大自由度88，最小自由度為1，平均自由度為15.99。見圖1。

2.3 CHD相關(guān)靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“疾病-靶點”網(wǎng)絡圖，圖中共有190節(jié)點組成，紅色圓形為疾病“CHD”，綠色矩形為疾病對應的靶點。節(jié)點與節(jié)點之間的邊表示疾病CHD與靶點蛋白之間的對應關(guān)系。見圖2。

2.4 核心靶點的篩選

通過網(wǎng)絡合并，獲得丹參-紅花和CHD的共有靶點22個，見表3。將這22個靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫建立“丹參-紅花化合物—CHD”靶點的PPI網(wǎng)絡，見圖3，共得到22個節(jié)點，95條邊，平均節(jié)點度為8.64;再將該結(jié)果以TSV格式導出，再通過Cytoscape3.7.2軟件對該網(wǎng)絡進行拓撲分析，以Degree值大于等于8為篩選標準，得到13個核心靶點，血栓調(diào)節(jié)蛋白（THBD）、凝血酶原（F2）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管細胞黏附蛋白1（VCAM1）、白細胞介素-1B（IL-1B）、γ干擾素（IFN-γ）、尿激酶型纖溶酶原激活劑（PLAU）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、E選擇素（SELE）、雌激素受體1（ESR1）、基質(zhì)溶素-1（MMP1）、髓過氧化物酶（MPO）。一起構(gòu)成核心網(wǎng)絡圖，見圖4。

2.5 生物通路及富集分析

將丹參-紅花治療CHD的PPI網(wǎng)絡篩選出的13個核心靶點進行富集分析，獲得核心靶點所參與的生物過程及通路。富集程度用顏色深淺表示，顏色越深表示富集程度越高。見圖5。圖6中節(jié)點代表不同通路的P值大小，圖7中不同顏色節(jié)點表示不同通路。

3 討論

中醫(yī)學中，CHD多屬于“胸痹”“真心痛”等范疇，基本病機多為本虛標實，本虛以氣虛為主、標實以血瘀為主[13]。由此可見，活血化瘀在治療CHD顯得尤為重要。歷代醫(yī)家也非常重視活血化瘀法治療胸痹心痛病，唐代孫思邈在《備急千金要方·心腹痛》中就利用活血化瘀法治療胸痹心痛病。明代王肯堂在《證治準繩·諸痛門》提出用大劑量桃仁、紅花等治療死血心痛，清代陳修園在《時方歌括》以丹參飲治療心腹諸痛，活血化瘀法應用在明清時期達到鼎盛。丹參-紅花配伍是臨床中常用的活血化瘀配伍藥對，丹參-紅花配伍具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效，被廣泛的應用于心、腦血管疾病的治療，臨床效果非常顯著?，F(xiàn)代研究表明，丹參的主要活性成分為酚酸類和二萜醌類，活性較好的主要包括水溶性的丹參素、丹酚酸B以及脂溶性的丹參酮等，具有改善血液循環(huán)以及抗炎等作用[6]，紅花的化學成分為黃酮類，如紅花黃色素，脂肪酸，其中紅花黃色素是心血管疾病中療效最顯著的化學物質(zhì)，在臨床上廣泛應用[14]。林玲等[15]在觀察5 183例丹紅注射液臨床用藥，分析指出丹紅注射液常用于治療CHD、高血壓、腦梗死等疾病，臨床安全性高。王媛[16]在丹紅注射液對CHD不穩(wěn)定型心絞痛的治療效果觀察中指出丹紅注射液治療CHD療效顯著。

我們運用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對丹參-紅花進行網(wǎng)絡藥理學分析，將丹參-紅花的有效成分作用靶點進行篩選并與CHD相關(guān)靶標進行取交集，構(gòu)建“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖，對網(wǎng)絡圖中的關(guān)鍵靶點進行生物通路和富集分析，得到丹參-紅花配伍治療CHD的可能與TNF、VCAM1、IL1B、IFNG、PLAU、VEGFA、MPO等靶點相關(guān)，進一步提示兩味藥在治療CHD多靶點、多組分的特點。TNF是一種與炎性反應相關(guān)的細胞因子，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生，TNF-α是非常重要的炎性反應遞質(zhì)之一，其能夠通過刺激相關(guān)血管生長因子的表達引起缺血后血管再生[17];VEGFA是VEGF家族中重要的成員，是促血管生成的重要因子[18];MPO是由單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞分泌的一種過氧化物酶，主要參與動脈粥樣硬化、腫瘤、腎炎以及白血病等疾病的發(fā)生和發(fā)展[19-21]。丹參-紅花合用較單獨使用在抗腦水腫、抗氧化、抗炎性反應等方面都有較強的作用，合用在治療心腦血管疾病都有更好的治療效果。藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡分析結(jié)果顯示丹參中的丹參酮ⅡA、木犀草素和紅花中的紅花黃色素涉及共有靶點數(shù)目最多，這些化學成分可能參與了丹參-葛配伍治療CHD的過程。通過GO功能和KEGG通路富集分析可以看出，丹參-紅花治療CHD主要靶點參與與流體剪切應力與動脈粥樣硬化、活性氧代謝過程、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、蛋白質(zhì)復合物裝配的正調(diào)控、細胞活化的調(diào)節(jié)等相關(guān)，其中聚集在流體剪切應力與動脈粥樣硬化的靶點最多，也進一步說明了丹參-紅花治療CHD的通路較多，機制較復雜，同時也提示該生物過程可能是未來研究丹參-紅花治療CHD的重要方向。

綜上所述，丹參-紅花在治療CHD涉及多通路、多靶點、多成分的特點，對丹參-紅花治療CHD的可能機制進行了研究和分析，為臨床上丹參-紅花配伍治療CHD提供了一條思路，但由于數(shù)據(jù)庫有限，有待進一步考察和研究。

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（2020-02-26收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制項目（2017ZX09301003）作者介紹：范吉林（1993.09—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病方向的研究，E-mail：930438217@qq.com通信作者：張世亮（1964.10—），男，博士，主任醫(yī)師，博士研究生導師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病方向的研究，E-mail：zhangshiliangsd@126.com