董 飛， 孫紅麗， 牛 楠， 李 卉， 趙 瑞， 王 嬋， 趙 巍，2

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究中心，銀川 750004）

急性腎損傷是以腎小球?yàn)V過功能下降為特征的常見臨床綜合征，產(chǎn)生的原因很多，如急性氧化應(yīng)激、細(xì)胞缺血缺氧、毒素成分暴露、炎癥及急性敗血癥等[1]，均可直接導(dǎo)致急性腎損傷，且患者發(fā)病率和死亡率相對(duì)較高。其中，缺血缺氧是導(dǎo)致急性腎損傷的主要原因之一[2]，并且在臨床報(bào)道中日益增多。研究結(jié)果顯示，短暫、急劇的急性缺氧代謝反應(yīng)，會(huì)直接造成人的腎小管細(xì)胞上皮實(shí)質(zhì)細(xì)胞大量凋亡的情況發(fā)生，可能導(dǎo)致人的腎小管實(shí)質(zhì)上皮細(xì)胞數(shù)量減少，最終影響人的腎功能[3]。核呼吸誘導(dǎo)因子-1（nuclearrespiratoryfactor-1，NRF-1）在細(xì)胞表達(dá)功能調(diào)控中具有重要調(diào)控作用。此外，NRF-1 還可能具有更廣泛的氧化作用，如在抑制血紅素酶和生物堿的合成、細(xì)胞功能凋亡、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞代謝等諸多方面都可能具有一定的氧化參與抑制作用[4-5]，但目前關(guān)于NRF-1 與細(xì)胞缺氧所致的急性腎細(xì)胞功能凋亡的一些相關(guān)醫(yī)學(xué)研究還尚未見明確報(bào)道。隨著我國分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，CRISPR/Cas9 基因編輯相關(guān)技術(shù)已廣泛遍布至全球各醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，因其自身具有技術(shù)設(shè)計(jì)靈活、簡易、可同時(shí)一次進(jìn)行多少個(gè)靶點(diǎn)的基因編輯等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于分子生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等多個(gè)研究領(lǐng)域[6-8]。本課題研究項(xiàng)目擬通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)分析構(gòu)建NRF-1 基因敲除的大鼠腎組織細(xì)胞，觀察缺氧所致的凋亡反應(yīng)發(fā)生時(shí)，NRF-1 對(duì)大鼠腎組織細(xì)胞基因凋亡功能水平的直接影響，初步分析探討上述兩者之間的相互關(guān)系，為大鼠腎損傷的基因治療研究提供一個(gè)可能的研究方向。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞及試劑

HEK-293FT 細(xì)胞由本中心實(shí)驗(yàn)室管理保存，大鼠腎細(xì)胞NRK-52E 購自上海中國科學(xué)院生物細(xì)胞生物庫。lenti-crispr 中的載體購于Addgene（#49535），載體結(jié)構(gòu)圖譜如圖1 所示；T7核酸內(nèi)切酶1（T7E1）、BsmBI 酶、T4 連接酶（NEB 公司）；DNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；AnnexinV/FITC 凋亡檢測試劑盒（BD 公司）；BCA 蛋白檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Bax、Bcl-2、caspas-3、Cleaved-caspase-3、HIF-1a 單克隆抗體和β-actin-HRP 單克隆抗體（abcam 公司）；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要儀器

小型臺(tái)式離心機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；電轉(zhuǎn)儀、PCR 擴(kuò)增儀、電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 NRF-1-sgRNA 的構(gòu)建 使用CRISPR 在線工具（http：//crispr.mit.edu）在NRF-1 基因第一個(gè)外顯子處篩選敲除NRF-1 基因的靶點(diǎn)序列。選取其中得分最高的兩個(gè)NRF-1-sgRNA 位點(diǎn)作為NRF-1 基因的敲除靶點(diǎn)，并在互補(bǔ)的兩個(gè)NRF-1-sgRNA 鏈上分別加上與BsmBI 酶切位點(diǎn)基因互補(bǔ)的堿基。合成兩種互補(bǔ)的sgRNAs 通過上海生物工程股份有限公司完成。

1.3.2 CRISPR/Cas9 質(zhì)粒酶切 在37 ℃條件下用限制性核酸內(nèi)切酶BsmBI 酶切l(wèi)entiCRISPR質(zhì)粒4 h，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切分析，使用DNA 純化回收試劑盒把分子量為11450 bp的線性質(zhì)粒DNA 回收。

1.3.3 lentiCRISPR-NRF-1-sgRNA 克隆及鑒定 將合成的互補(bǔ)的單鏈NRF-1-sgRNA 梯度退火形成雙鏈，按照95 ℃5 min、95 ℃～85 ℃，-2 ℃/s、25 ℃5 min、16 ℃5 min、4 ℃保存的過程進(jìn)行。在16 ℃條件下用T4 連接酶將膠純化回收的線性化載體lentiCRISPR 與稀釋100 倍后的雙鏈DNA 按照3∶2 的比例連接12 h；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，接種于含Amp 的LB 固體培養(yǎng)板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h；把陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，通過測序驗(yàn)證其插入sgRNA 的序列是否正確。測序由上海生物工程股份有限公司完成。

1.3.4 慢病毒包裝 將293FT 細(xì)胞培養(yǎng)至10 cm培養(yǎng)器皿中，待其完全匯合度為80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入5 mL 新配的培養(yǎng)液。在3 個(gè)無菌的EP 管中分別加入500 μL DMEM，每一個(gè)管分別加入6 μg plp1、6 μg plp2 和6 μg plpvs，隨后分別加6 μg lentiCRISPR-sg1 和6 μg lentiCRISPRsg2，并以6 μg lentiCRISPR 為對(duì)照，渦旋震蕩混勻；另外3 個(gè)無菌的EP 也在管中分別依次加入500 μL DMEM 上清培養(yǎng)液和40 μL polyJet 進(jìn)行轉(zhuǎn)化感染上清試劑，混勻后，立即將兩個(gè)含少量polyjet 的上清混合液分別依次加入到3 個(gè)含質(zhì)粒的上清混合液中，慢慢振蕩混勻，室溫下靜置15 min，將其滴定后加至每個(gè)細(xì)胞上清中，混合均勻后將其放至細(xì)胞培養(yǎng)箱中再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后棄去上清培養(yǎng)液，加入10 mL 含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清，4 ℃，3000×g離心10 min。將細(xì)胞上清液在0.45 μm 的病毒細(xì)菌液過濾器中進(jìn)行過濾后，50000×g離心2 h，丟棄上清，500 μL DMEM 培養(yǎng)液重懸病毒顆粒，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 T7E1 酶切驗(yàn)證 按照5×105個(gè)/孔將NRK-52E 細(xì)胞接種到12 孔板后過夜培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，將新配的DMEM 完全培養(yǎng)液加入1 mL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h，首先每孔加入1 μL 聚凝胺（8mg·mL-1），然后分別加入5、10、15、20、25、30、35、40、45 和50 μL 的病毒液，同時(shí)以30 μL 空病毒作為陰性對(duì)照，慢慢混勻放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后丟棄含病毒的培養(yǎng)液，分別加含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)液（0.9 μg·μL-1）篩選陽性克?。? d 后將細(xì)胞通過流式單選法接種至96 孔板并擴(kuò)大培養(yǎng)，取一部分細(xì)胞提取基因組DNA，PCR 擴(kuò)增含敲除靶點(diǎn)的片段（上游引物:ATCAAATGCTAATCCCTG，下游引物:AACCACCGTCATAACACTA），產(chǎn)物大小為833 bp，將野生型與野生型PCR 產(chǎn)物、野生型與突變型PCR 產(chǎn)物、突變型與突變型PCR 產(chǎn)物變性退火形成雜交的DNA，T7E1 酶切30 min（37 ℃），用1%瓊脂糖凝膠電泳挑選有效的敲除靶點(diǎn)。提取流式單選法擴(kuò)大培養(yǎng)的lentiCRISPRNRF-1-sgRNA2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組DNA，PCR擴(kuò)增包括敲除靶點(diǎn)的片段，將PCR 產(chǎn)物克隆至pClone007-vector 進(jìn)行測序并通過生物信息學(xué)分析堿基的缺失情況。1.3.6 Western blot 驗(yàn)證NRK-52E 細(xì)胞中NRF-1 蛋白表達(dá)水平 將成功敲除并單選以后擴(kuò)增的三株NRF-1 基因敲除的細(xì)胞分別命名為mutant1、mutant2、mutant3 細(xì)胞，分別將mutant1、mutant2、mutant3、空載體組（vector）和正常對(duì)照組（control）的細(xì)胞分別按照1×106個(gè)接種至6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，提取各組細(xì)胞中的總蛋白，測蛋白濃度。通過100 ℃10 min 使得蛋白變性，取30 μg進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用SD 半干轉(zhuǎn)儀在電壓20 V經(jīng)過45 min 轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，0.2%PBST 封閉8h，4℃孵育一抗（NRF-1 1∶1000，β-actin 1∶50000）12 h，1% PBST 洗膜4 次，室溫（25 ℃）孵育二抗（山羊抗兔IgG 1∶5000）1 h，洗膜4 次后曝光。使用Image Lab5.2 軟件分析灰度值，用目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 氯化鈷（CoCl2）濃度對(duì)正常NRK-52E 細(xì)胞活性的影響 96 孔板每孔接種5×103個(gè)正常的NRK-52E 細(xì)胞后在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，加入CoCl2（終濃度為100、200、300、400、500、600、700 μmol·L-1）后37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入10 μL CCK-8 液繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，450 nm 處測吸光度值后計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力（%）=（OD加藥組-OD空白對(duì)照組）/（OD對(duì)照組-OD空白對(duì)照組）×100%。

1.3.8 Annexin V-FITC/PI 測定細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞按照1×106個(gè)接種至6 cm 培養(yǎng)皿中過夜培養(yǎng)，然后分別加入含CoCl2的完全培養(yǎng)液（終濃度為600 μmol·L-1）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用無Ca2+、EDTA的0.25%的胰酶消化細(xì)胞后用PBS 洗滌。然后取500 μL 細(xì)胞懸液分別加入5 μL Annexin V- FITC和5 μL PI，輕輕混勻后室溫避光放置15 min，隨后加入400 μL 1×Binding Buffer，用流式細(xì)胞儀器檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.9 凋亡相關(guān)蛋白水平的檢測 將NRF-1 敲除組（mutant3）、空載體組（vector）和正常對(duì)照組（control）細(xì)胞分別用含CoCl2的完全培養(yǎng)液（終濃度為600 μmol·L-1）培養(yǎng)24 h，首先提取總蛋白測定蛋白濃度，蛋白免疫印跡法（方法同1.3.6）檢測各組細(xì)胞總蛋白中HIF-1a、Cleaved-caspase-3、Caspas-3、Bax、Bcl-2 和β-actin 的表達(dá)水平。抗體稀釋倍數(shù)：HIF-1a、Cleaved-Caspase-3、caspase3、Bax、Bcl-2 均為1∶1000，β-actin 為1∶50000，山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 為1∶50000。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 軟件繪圖。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lentiCRISPR-NRF-1-sgRNAs 的鑒定

構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒lentiCRISPR-NRF-1-sgRNA 并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，NRF-1-sgRNA1 及NRF-1-sgRNA2 正確插入到lentiCRISPR 質(zhì)粒中（圖2）。

2.2 sgRNA 活性的鑒定

2.2.1 T7EI 酶切驗(yàn)證 提取慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的基因組DNA，PCR 擴(kuò)增包含敲除靶點(diǎn)的片段（產(chǎn)物的大小為833 bp），把擴(kuò)增的野生型與突變型PCR 產(chǎn)物、突變型與突變型PCR 產(chǎn)物、野生型與野生型PCR 產(chǎn)物退火形成雜交的DNA，T7EI酶切后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳顯示兩個(gè)大小為469 bp 和364 bp 的DNA 片段，證明NRF-1基因的有效靶點(diǎn)是sgRNA2（圖3）。

2.2.2 Sanger 測序 把lentiCRISPRsg-RNA2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組DNA 提取出來，PCR 擴(kuò)增包含敲除靶點(diǎn)的片段，將PCR 產(chǎn)物克隆至pClone007-vector 上后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，把突變型細(xì)胞的測序結(jié)果與野生型細(xì)胞的測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示獲得了1 個(gè)基因缺失的單克隆細(xì)胞株，與野生型的NRK-52E 細(xì)胞的測序結(jié)果比較，突變型單克隆細(xì)胞中缺失9 個(gè)堿基（圖4）。

2.3 Western blot 驗(yàn)證NRK-52E 細(xì)胞中NRF-1蛋白表達(dá)水平

為驗(yàn)證堿基缺失的單克隆細(xì)胞株中NRF-1蛋白的表達(dá)水平，提取敲除組細(xì)胞株、空載體、正常細(xì)胞株的總蛋白，NRF-1 蛋白的表達(dá)水平通過Western blot 法檢測（圖5A）。與vector 組細(xì)胞株比 較，mutant1、mutant2、mutant3 各 組 細(xì) 胞 株 中NRF-1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）（圖5B）。我們將選取敲除效果最明顯的mutant3 組細(xì)株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。

2.4 CoCl2 濃度對(duì)正常NRK-52E 細(xì)胞活性的影響

與正常培養(yǎng)的細(xì)胞比較，濃度為500、600、700 μmol·L-1的CoCl2均可降低細(xì)胞活性（P均＜0.05）（圖6）。

2.5 Annexin V-FITC/PI 測定細(xì)胞凋亡情況

600 μmol·L-1的CoCl2刺激細(xì)胞后，mutant組（10.4±0.52）%細(xì)胞凋亡率高于control 組（4.7±0.21）%和vector 組（4.0±0.19）%（P均<0.01）（圖7）。

2.6 凋亡相關(guān)蛋白水平的檢測

與vector 組比較，mutant 組中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1a、凋亡蛋白Cleaved-caspase3、促凋亡分子Bax 表達(dá)水平均升高，抗凋亡分子Bcl-2 表達(dá)水平下降（P均<0.01）（圖8）。

3 討論

近年來，有關(guān)急性腎損傷發(fā)生時(shí)，腎細(xì)胞凋亡研究的報(bào)道越來越多[9]，而在引起急性腎損傷的眾多原因中，缺血或非缺血腎組織缺氧是導(dǎo)致急性腎損傷的重要原因之一。CoCl2是目前國內(nèi)外常用建立體外缺氧模型的缺氧誘導(dǎo)劑[10]。在CoCl2作用條件下，通過Co2+置換Fe2+從而影響氧的利用，進(jìn)而抑制HIF-1α 降解，形成缺氧環(huán)境[11]。HIF-1α 是細(xì)胞在低氧條件下產(chǎn)生的蛋白性調(diào)節(jié)因子，能使機(jī)體產(chǎn)生低氧適應(yīng)反應(yīng)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用含CoCl2的完全培養(yǎng)液（終濃度為600 μmol·L-1）將NRF-1 基因敲除腎細(xì)胞、正常腎細(xì)胞及空載體腎細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，HIF-1a 增高。因此改善或者緩解缺氧條件下細(xì)胞凋亡從而改善急性腎損傷具有重要的意義。但是目前臨床研究的治療并不完善，因此基因治療可能會(huì)成為臨床上治療急性腎損傷新的技術(shù)。

NRF-1 最初的研究是在關(guān)于細(xì)胞色素C 的研究中，并且目前關(guān)于其研究主要聚焦于對(duì)線粒體能量代謝的調(diào)控中，關(guān)于細(xì)胞凋亡的研究并不多。Zhang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NRF-1 基因在山羊卵泡顆粒細(xì)胞（LGCs）的凋亡中發(fā)揮作用，通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，NRF-1 沉默的LGCs 的凋亡率顯著增高。前期的研究中發(fā)現(xiàn)[14]，過表達(dá)大鼠心肌細(xì)胞H9C2 中的NRF-1 基因時(shí)，可使缺氧條件下細(xì)胞的凋亡水平降低。為了反向證明NRF-1 在腎細(xì)胞凋亡中是否也有這樣的作用，本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，敲除NRK-52E 細(xì)胞的NRF-1 基因，研究其在CoCl2誘導(dǎo)時(shí)對(duì)NRK-52E 細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，在CoCl2誘導(dǎo)缺氧條件下敲除組細(xì)胞凋亡率高于空載體組和正常對(duì)照組，進(jìn)一步說明了NRF-1 在缺氧條件下的抗凋亡作用。

Bcl-2 和Bax 是線粒體PT 孔道的組成成分，細(xì)胞凋亡過程啟動(dòng)后，Bax 從胞漿中轉(zhuǎn)移至線粒體膜上，介導(dǎo)PT 孔開放，凋亡相關(guān)物質(zhì)經(jīng)開放的通道轉(zhuǎn)移至胞漿中[15-16]。Bcl-2 的抗凋亡作用是通過阻止cyt-c 的釋放發(fā)揮作用。Caspase3 是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，正常情況下，細(xì)胞中的Caspase3 沒有活性，當(dāng)細(xì)胞凋亡被啟動(dòng)時(shí)，凋亡執(zhí)行分子Caspase3 就會(huì)被激活，從而發(fā)生不可逆的凋亡過程[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，NRK-52E 細(xì)胞中的NRF-1 基因敲除后，在缺氧條件下抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)水平上調(diào)，而促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)Cleaved-caspase3 的表達(dá)水平增高。以上結(jié)果說明，NRF-1 基因敲除增強(qiáng)了CoCl2誘導(dǎo)缺氧應(yīng)激條件下NRK-52E 細(xì)胞凋亡水平。

綜上所述，NRK-52E 細(xì)胞中的NRF-1 基因敲除后，可以增加CoCl2所致的缺氧條件下細(xì)胞的凋亡水平。揭示了NRF-1 基因可能的抗凋亡效應(yīng)，為尋找治療急性腎損傷的靶分子提供了可能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。