嚴 姣， 李亞妮， 郝樂樂， 宋 輝， 劉賀榮， 陳 楠

（寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，銀川 750004）

甲醇是一種有毒的酒精氣味液體。目前已經被大規(guī)模生產并使用，且甲醇職業(yè)人群也相應增加，這就為我國的職業(yè)衛(wèi)生工作提出了新的挑戰(zhàn)。甲醇主要經消化道、呼吸道、皮膚進入機體后可致眼毒性、代謝性酸中毒、神經毒性[1]。目前，國內外對于甲醇的毒性多集中于眼部損害及代謝性酸中毒，對中樞神經系統(tǒng)作用主要集中在影像學方面[2]，而甲醇中樞神經毒性研究較少。本課題組前期發(fā)現(xiàn)[3]甲醇對大鼠染毒后對大鼠大腦產生氧化應激作用并可激活線粒體細胞凋亡途徑引起神經細胞凋亡。甲醇可以致機體產生氧化應激[4]，另有研究報道[5]甲醇可以誘導線粒體DNA 損傷。因此本課題研究以甲醇為受試物，對人神經母細胞瘤細胞（SK-N-SH）進行染毒后，用流式細胞儀、單細胞瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞氧化應激水平、DNA 損傷情況，探討SK-N-SH 細胞氧化應激與DNA 損傷情況及二者的關系，為甲醇的神經毒性研究提供進一步的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

甲醇（天津瑞金特化學品有限公司，中國），胎牛血清（Biological Industries，以色列），MEM 培養(yǎng)基（上海中橋新舟，中國），活性氧（ROS）檢測試劑盒（碧云天，中國），熒光顯微鏡（Olympus，日本），流式細胞儀（Sysmex，日本），電泳儀（Tanon，中國）。

1.2 細胞培養(yǎng)與染毒

本課題組前期通過CCK-8 法檢測SK-NSH 細胞增殖活力[6]，分別用0、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000 mmol·L-1濃度的甲醇染毒24、48 h，染毒48 h 后擬合的線性回歸方程為Y=1.10767-0.00047X，R2=0.98，可以看出隨著染毒劑量的增加，細胞毒性也逐漸增強。通過擬合的回歸方程可計算出IC50=1292.96 mmol·L-1，由此選擇0、250、750、1250 mmol·L-1為染毒劑量組。

SK-N-SH 細胞（購買于上海科學院細胞庫）用完全培養(yǎng)液（10%FBS+89%MEM+1%抗生素）重懸，加入3 mL 細胞懸液于培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2 d 換液1 次，3～4 d 傳代1次。取同批次對數(shù)期生長良好的細胞將其制成2.5×105/mL 細胞懸液，分別接種于對照、低、中、高甲醇濃度組，每組3 孔，每孔2 mL 的6 孔板中，24 h 后棄舊培養(yǎng)液，加入含不同濃度甲醇（0、250、750、1250 mmol·L-1）的新培養(yǎng)液1.5 mL，染毒24 h。

1.3 流式細胞儀檢測ROS 水平

染毒24 h 后，用胰酶（不含EDTA 和酚紅）消化細胞，收集細胞于離心管中，1000 r·min-1，離心5 min，棄上清。PBS 洗滌細胞2 次，800 r·min-1離心3 min，加入1 mL DCFH-DA（按照1∶4000 用無血清培養(yǎng)液稀釋），37 ℃孵育30 min。洗滌3 次，每次5 min，800 r·min-1離心3 min 后，加入300 μL 無血清培養(yǎng)液重懸細胞。用流式細胞儀進行檢測，其結果采用Flowjo 軟件分析。實驗重復3 次。同樣方法處理細胞后熒光顯微鏡下直接觀察細胞內ROS 熒光強度。

1.4 單細胞瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 損傷

染毒24 h 后，消化收集細胞，制成單細胞懸液。取10 μL 細胞（大約5000 個）加120 μL 0.5%LMP 混勻，滴加到制備含1.5% NMP 的載玻片上，放置。10 min 后，將其置于細胞裂解液中，4 ℃避光裂解至少1 h。取出玻片，無菌水清洗3 次，將其置于電泳槽，加入堿性的電泳緩沖液，4 ℃避光解旋30 min。25 V、300 mA 電泳30 min。緩沖液中和2 次，每次10 min，吸去殘留液體，無菌水清洗載玻片，室溫晾干，滴加30 μL EB 染色。熒光顯微鏡觀察每一濃度隨機選擇100 個細胞，記錄拖尾細胞數(shù)，計算拖尾率。采用CometIMI 軟件記錄拖尾細胞數(shù)及測量拖尾長度。拖尾率（%）=拖尾細胞數(shù)/總觀察細胞數(shù)。平均拖尾長度（μm）=拖尾長度之和/拖尾細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素的方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。關聯(lián)性分析采用Pearson 相關分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ROS 水平變化

對照組、低、中、高濃度甲醇組細胞內ROS水平分別為（7.72±2.10）%、（10.88±2.60）%、（12.87±1.17）%、（15.83±1.60）%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=9.23，P<0.05）。與對照組相比，中、高濃度組細胞內ROS 水平上升（P均<0.05）；與低濃度甲醇組相比，高濃度甲醇組細胞內ROS 水平上升（P<0.05）。見圖1、表1。

表1 甲醇染毒SK-N-SH 細胞24 h 后細胞內ROS 水平（±s）

表1 甲醇染毒SK-N-SH 細胞24 h 后細胞內ROS 水平（±s）

與對照組相比*P<0.05，**P<0.01；與低濃度甲醇組相比#P<0.05

組別 n ROS 水平/%對照組 3 7.72±2.10低濃度甲醇images/BZ_41_1533_1468_1540_1470.png組 3 10.88±2.60中濃度甲醇組 3 12.87±1.17*高濃度甲醇組 3 15.83±1.60**#

2.2 DNA 損傷程度

如圖2、表2 所示，對照組、低、中、高濃度組細胞發(fā)生拖尾的平均拖尾長度分別為（19.03±4.58）μm、（52.85±21.60）μm、（72.95±15.29）μm、（73.62±16.80）μm，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=26.09，P<0.01）。對照組、低、中、高濃度甲醇組細胞發(fā)生拖尾的拖尾率分別為（3.15±0.97）%、（23.92±5.02）%、（58.74±18.27）%、（61.78±11.10）%，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=66.32，P<0.01）。與對照組相比，低、中、高濃度甲醇組平均拖尾長度及拖尾率升高（P均<0.01）；與低濃度甲醇組相比，中、高濃度甲醇組平均拖尾長度及拖尾率升高（P均<0.01）。

表2 甲醇染毒SK-N-SH 細胞24 h 后細胞內DNA 損傷水平變化（±s）

表2 甲醇染毒SK-N-SH 細胞24 h 后細胞內DNA 損傷水平變化（±s）

與對照組相比**P<0.01；與低濃度甲醇組相比##P<0.01

組別 n 平均拖尾長度/μm 拖尾率/%對照組 3 19.03±4.58 3.15±0.97低濃度甲醇組 3 52.85±21.60** 23.92±5.02**中濃度甲醇組 3 72.95±15.29**## 58.74±18.27**##高濃度甲醇組 3 73.62±16.80**## 61.78±11.10**##

2.3 ROS 與DNA 損傷相關性分析

ROS 水平與DNA 拖尾長度呈正相關關系（r=0.818，P<0.01），表明隨著氧化應激水平增加神經細胞DNA 損傷水平也增加。

3 討論

甲醇廣泛生產使用給人們帶來效益與便利，但是對職業(yè)人群也造成不可忽視的損傷。甲醇中毒是全球性問題，在幸存者中死亡率高，長期存在視覺后遺癥和嚴重的腦損傷[7]。有研究表明[8]，甲醇可引起大鼠神經膠質纖維酸性蛋白星形膠質細胞數(shù)量明顯減少及海馬區(qū)嚴重的記憶障礙。Bezdicek 等[9]進行橫斷面研究發(fā)現(xiàn)甲醇中毒會導致執(zhí)行功能障礙和記憶力減退。Kang 等[10]通過職業(yè)中毒事件發(fā)現(xiàn)不良環(huán)境控制下的甲醇暴露不僅會產生眼部損傷和中樞神經系統(tǒng)癥狀，還影響其神經行為和視神經功能。課題組前期研究表明，甲醇可導致大鼠神經細胞凋亡，出現(xiàn)神經行為異常改變[11]，而氧化應激是許多神經系統(tǒng)性疾病的關鍵起始因子[12]，其主要被認為參與阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病等神經退行性疾病[13]。由于大腦的抗氧化防御機制相對較差，可刺激神經細胞發(fā)生氧化應激產生ROS。ROS 的過量產生會損害細胞生物分子，如蛋白質、脂質和核酸，并誘導多種類型細胞中的DNA損傷。有研究報道[14]，當中樞神經系統(tǒng)損傷時，ROS 主要攻擊對自由基特別敏感的有絲分裂后的細胞，如神經膠質細胞和神經元。本實驗中對照、低、中、高濃度甲醇分別作用于SK-N-SH 細胞24 h 后，不同濃度甲醇染毒SK-N-SH 細胞內ROS 水平升高，隨著染毒濃度增加，甲醇各濃度組細胞內ROS 相對水平增高，這表明甲醇對SK-N-SH 細胞產生的損傷可能與其細胞內ROS水平有關。

ROS 的水平增加也是DNA 損傷的一種機制，ROS 引起的氧化應激和各種原因誘導的DNA 損傷超過了機體自我修復的能力將會對機體造成各種損傷[15]。DNA 損傷在神經元中的積累與神經退行性疾病的發(fā)生也有關，已知的很多神經退行性疾病都是由于DNA 損傷缺陷引起的[16]。本實驗中對照、低、中、高濃度甲醇分別作用于SK-N-SH 細胞24 h 后，采用彗星實驗技術檢測SK-N-SH 細胞DNA 損傷情況，顯微鏡下拍照發(fā)現(xiàn)隨著甲醇濃度增高，細胞發(fā)生拖尾的數(shù)量逐漸增多，拖尾長度也逐漸增長。隨著甲醇染毒濃度增加，平均拖尾長度及細胞拖尾率也增加，提示甲醇可能會誘導神經細胞發(fā)生DNA 損傷，且濃度越大，損傷程度可能越嚴重。

諸多研究發(fā)現(xiàn)氧化應激與DNA 損傷之間關系密切。DNA 損傷可能是由直接與DNA 相互作用或通過氧化應激誘導的ROS 產生引起的[17]。Jiao 等[18]研究表明甲基丙烯酰基乙基十六烷基氯化銨通過產生氧化應激，從而通過修飾信號轉導途徑觸發(fā)誘導人牙髓細胞DNA 損傷。Pignataro等[19]利用細胞質雜交細胞發(fā)現(xiàn)當神經母細胞瘤細胞分化為多巴胺能神經元樣細胞時，PD 63 細胞內ROS 水平和慢性DNA 損傷應答激活之間呈正相關，這表明ROS 的產生確實是導致細胞核DNA 損傷的原因。Chang 等[20]研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥可能是通過增加ROS 的產生而導致線粒體DNA氧化性損傷。Rawat 等[21]研究表明高膽紅素誘導的氧化應激似乎是導致體外DNA 損傷的主要機制。這些研究都表明氧化應激可直接參與引起DNA 損傷的反應。本次實驗中DNA 損傷的結果與甲醇造成的細胞ROS 含量變化的結果相一致，且通過ROS 水平與DNA 損傷相關性分析得出二者之間有相關關系且呈高度相關，這也說明甲醇的暴露導致細胞內ROS 含量的升高，從而引起了細胞的脂質過氧化反應，對細胞的DNA造成了氧化損傷。

綜上所述，甲醇能誘導SK-N-SH 神經細胞能產生氧化應激與DNA 損傷，其可能的機制是通過誘導SK-N-SH 細胞發(fā)生氧化應激從而產生DNA 損傷反應，但是此結論還需要通過后續(xù)實驗進一步的研究來證實這一可能機制。