楊婷婷， 王雅蓉， 戰(zhàn)仕勝， 賈琴琴， 王秀青

（寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，每年診斷出新病例超過180 萬，總體生存率很低，只有約15%的患者在初次診斷后5 年內(nèi)存活[1]，而普通的外科手術(shù)切除治療、放化療并不能減少肺癌的發(fā)生率[2-3]。因此，探討肺癌的發(fā)生發(fā)展規(guī)律對(duì)肺癌的治療具有重大意義。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶家族的一個(gè)亞族，是一種傳遞絲裂原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，其所參與的信號(hào)通路與大部分腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡相關(guān)[4]。ERK 序列和結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一個(gè)高度保守的狀態(tài)。ERK的特征在于其激活主要由TEY 殘基發(fā)揮作用，在生長(zhǎng)因子及藥物多肽等刺激作用下將信號(hào)由細(xì)胞外傳遞到核內(nèi)，從而調(diào)控細(xì)胞生理活動(dòng)。ERK/CJUN 氨基末端激酶（C-JUN nterminal kinase，JNK）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的重要通路，其異常激活調(diào)控著細(xì)胞的凋亡、增殖與分化[5]。以往研究ERK 功能及相關(guān)機(jī)制采取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，考慮到ERK 外源基因在肺癌中高表達(dá)等問題不利于研究ERK 活性在肺癌細(xì)胞增殖中的具體機(jī)制，本研究旨在通過對(duì)ERK 進(jìn)行穩(wěn)定過表達(dá)，探究ERK 過表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及ERK/JNK 通路中相關(guān)蛋白的影響，以期為后續(xù)研究腫瘤發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 來源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院干細(xì)胞研究所；PCDH 載體購(gòu)自美國(guó)SBI公司；大腸桿菌菌株DH5α、293T 細(xì)胞株購(gòu)自天根生化科技有限公司；EZNA Total RNA KITI 購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑RPMI1640、胰蛋白酶、雙抗均購(gòu)自美國(guó)Gibico 公司；限制性內(nèi)切酶NotI 和XbaI、T4 DNA 連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB 公司；去內(nèi)毒素小量提取試劑盒、大量質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購(gòu)自天根生化有限公司；Protoscript II first strand cDNA 合成試劑盒、Q5 hot start 高保真聚合酶購(gòu)自NEB 公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipo-3000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；引物及測(cè)序由上海生工有限公司完成；P-ERK、ERK、P-CMYC 等單克隆抗體購(gòu)自Abcam 有限公司。倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；電泳儀、免疫印跡實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自北京市六一儀器廠；PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；高壓蒸汽滅菌器購(gòu)自日本TOMY 公司；Multiskan GO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 合成目的基因ERK 并連接至PCDH 載體 根據(jù)Genebank 中人ERK 基因序列，其CDS 區(qū)為NM138957.3，全長(zhǎng)為1083 bp 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增ERK CDS 序列，根據(jù)載體pCDH-CMV-MCS-EF1α-GreenPuro 序列特征引入XbaI 和NotI 的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，合成目的片段。按照引物設(shè)計(jì)原則，用primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，根據(jù)載體酶切位點(diǎn)在寡合苷酸兩端分別加上XbaI 和NotI 限制性酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。引物設(shè)計(jì)如下：上游引物序列5'-CTAGT CTAGAGCCACCA TGGCGGCGGCGGCGGCG-3'，下游引物序列5'CTTCGCGGCCGCTTAAGATCTGTATCCT GGCT-3'，在A549細(xì)胞中提取RNA 并檢測(cè)質(zhì)量和濃度，通過RTPCR 技術(shù)獲取ERK 基因，其反應(yīng)條件為98 ℃，30 s；98 ℃，10 s；72 ℃，60 s；共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃，2 min；PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定回收，載體進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠純化，用T4連接酶將酶切片段與線性化載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂至含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基，設(shè)置空載體質(zhì)粒涂板進(jìn)行對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日挑取若干陽性菌落提質(zhì)粒，用兩種限制性內(nèi)切酶NotI 和XbaI 進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定是否重組成功。選取部分陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 用293T 細(xì)胞對(duì)重組慢病毒載體進(jìn)行包裝 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T 細(xì)胞接種至100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用Opti-MEM 進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～90%匯合度時(shí)將重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒用lipo3000 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，對(duì)照組設(shè)置為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，用Opti-MEM 稀釋Lipo-3000，將四種質(zhì)粒（測(cè)序成功的pCDH-CMV-MCS-EF1α-GreenPuro-ERK 慢病毒重組質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒plp1、plp2 和plp/vsvg）與脂質(zhì)體混合物室溫孵育10～15 min，隨后加入到293T 細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，37 ℃孵育細(xì)胞6 h 后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 和48 h 后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，離心，去除細(xì)胞碎片，然后收集病毒上清液，利用超速離心法：4 °C，82700×g，離心120 min，對(duì)其超速離心濃縮，最后得到高滴度的慢病毒超離液。

1.2.3 慢病毒滴度測(cè)定 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T 細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1×105/mL，加入96孔板，100 μL/孔，為每個(gè)病毒準(zhǔn)備6 個(gè)孔。放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2 天，準(zhǔn)備6 個(gè)1.5 mL EP 管，第1 個(gè)EP 管中加入10 μL病毒液，然后做3 倍梯度稀釋，共6 個(gè)稀釋度。第3 天，有需要加puromycin 篩選的孔，先吸去100 mL 含病毒培養(yǎng)基，加入100 μL 含1.5 μg·mL-1puromycin 的10% FBS 完全培養(yǎng)基。第5 天，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，觀察結(jié)果前6 h 需更換新鮮10 %FBS 完全培養(yǎng)基，從孔中吸出80 μL 培養(yǎng)基，然后加入80 μL 新鮮10 % FBS 完全培養(yǎng)基，放入37 °C ，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h 后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，熒光百分比在10% ～50% 的孔計(jì)算病毒滴度。病毒滴度（TU·mL-1）= 細(xì)胞數(shù)×陽性克隆百分比×感染復(fù)數(shù)（MOI）×病毒稀釋倍數(shù)×103。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞株 將A549 細(xì)胞分為空白組（A549 細(xì)胞）、空載體組（慢病毒空載體轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞）、過表達(dá)ERK 組（轉(zhuǎn)染過表達(dá)ERK 慢病毒的A549 細(xì)胞），待A549 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，用胰酶消化并收集，將細(xì)胞稀釋至細(xì)胞密度為1.5×105/mL，接種于六孔板，24 h 后按不同MOI 加入慢病毒，添加polybrene 助染。病毒感染24 h 后，棄去病毒感染液，換新鮮完全培養(yǎng)基。在感染24 h、48 h 后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)并拍照。

1.2.5 Puromycin 篩選穩(wěn)定表達(dá)ERK 的A549 細(xì)胞系 因本重組慢病毒載體上帶有puromycin 抗性基因，采用puromycin 處理，篩選出成功感染病毒的細(xì)胞。利用嘌呤霉素殺滅曲線確定能夠殺死含有空載體A549 細(xì)胞的最低puromycin 濃度，將A549 細(xì)胞接種于24 孔板使第2 天融合率為60%，24 h 后分別加入含不同濃度puromycin 的新鮮培養(yǎng)基，在8 個(gè)孔中分別加入終濃度為0 、0.5、1、2、4、6、8、10 μg·mL-1的puromycin。隨后每孔用各自濃度的puromycin 繼續(xù)處理48 h，進(jìn)一步觀察細(xì)胞的死亡情況，最終測(cè)得能夠殺死A549空載體細(xì)胞的最低puromycin 濃度為1μg·mL-1。以摸索到的puromycin 濃度處理細(xì)胞，48 h 后換新鮮的含有puromycin 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行篩選。

1.2.6 篩選細(xì)胞的放大培養(yǎng) 利用puromycin 篩選完兩代A549 細(xì)胞后，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后收樣做Real-time PCR 檢測(cè)，檢測(cè)過表達(dá)倍數(shù)最高且狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行凍存。在凍存細(xì)胞系以后需進(jìn)行復(fù)蘇驗(yàn)證，本次實(shí)驗(yàn)復(fù)蘇出的A549 細(xì)胞ERK 空載體對(duì)照穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和過表達(dá)ERK 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系狀態(tài)良好，細(xì)胞存活率高且無污染。

1.2.7 Real-time PCR 檢測(cè)目標(biāo)分子mRNA 表達(dá)Trizol 法提取細(xì)胞中總RNA，利用PCR 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，引物序列見表1。Real-time PCR 反應(yīng)條件為95 ℃，180 s；94 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)，隨后95℃，10s；65℃，60s；97℃，1 s。

表1 Real-Time PCR 引物序列

1.2.8 Western blot 檢測(cè)過表達(dá)后ERK 變化 用含有濃度1 μg·mL-1的嘌呤霉素培養(yǎng)基傳代普通未轉(zhuǎn)染載體的A549 細(xì)胞，ERK 過表達(dá)后的A549 細(xì)胞、含有空載體的A549 細(xì)胞，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后收集細(xì)胞，裂解，提取總蛋白，按一抗1∶1000 稀釋，以β-Tubulin 為內(nèi)參蛋白，4 ℃孵育過夜，二抗室溫2 h，洗膜三次后用ECL 試劑盒顯影特異蛋白條帶。

1.2.9 CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn) 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的過表達(dá)ERK 組、空載體組及空白組A549 細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種于96 孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別在0 h、24 h、48 h、72 h 加入10 μL 的CCK-8 試劑并在37 ℃孵育2 h，檢測(cè)450 nm 處吸光度值。

1.2.10 劃痕實(shí)驗(yàn) 在六孔板中接種適宜數(shù)量的生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的過表達(dá)ERK 組、空載體組及空白組A549 細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，用100 μL 無菌吸頭于六孔板中間畫一直線，用PBS清洗后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，拍照并計(jì)算細(xì)胞遷移率。遷移率（%）=（初始劃痕寬度值-24 h 后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.2.11 Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell 小室中于上室均勻加入100 μL Matrigel 膠，下室加入含20%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的過表達(dá)ERK 組、空載組及空白組A549 細(xì)胞，以3×104個(gè)接種于小室，37 ℃培養(yǎng)24 h 后取出上室，4%多聚甲醛處理，結(jié)晶紫染色并觀察。

1.2.12 Western blot 檢測(cè)ERK/JNK 通路部分蛋白變化 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的過表達(dá)ERK 組、空載體組及空白組A549 細(xì)胞培養(yǎng)至生長(zhǎng)密度80%左右時(shí)，加入冷PBS 洗兩次；加入配制好的預(yù)冷Lysis Buffer，冰上裂解30 min，取上清為全蛋白提取物，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白上樣，按Western blot 正常步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨后根據(jù)ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作，置于化學(xué)發(fā)光儀曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERK 基因合成及重組載體的構(gòu)建和鑒定

ERK 基因CDS 區(qū)全長(zhǎng)1083 bp，經(jīng)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出目的條帶后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠檢測(cè)儀檢測(cè)可以看到在1083 bp處有明顯DNA 條帶，電泳結(jié)果與理論結(jié)果一致（圖1A）；經(jīng)T4 連接酶重組連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)進(jìn)行涂板，挑取可疑菌落，37 ℃搖菌16～18 h 后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行初步鑒定，經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaI 和NotI 酶切后，可觀測(cè)到切出目的基因片段（圖1B）；在細(xì)菌培養(yǎng)皿上挑選9 個(gè)可疑陽性克隆進(jìn)行菌落擴(kuò)增后行初步酶切鑒定，凝膠分析結(jié)果顯示1～9 號(hào)樣本得到與預(yù)期分子質(zhì)量大小較一致的條帶，其中5 號(hào)條帶表達(dá)較弱（圖1C）。隨后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明ERK 過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。

2.2 慢病毒包裝及滴度測(cè)定

將慢病毒包裝質(zhì)粒plp1、plp2 和plp/vsvg 與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，用熒光顯微鏡分別觀察24 h、48 h 熒光表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上，說明轉(zhuǎn)染成功（圖3）。采用有限稀釋計(jì)數(shù)法，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，用熒光百分比在10%～50% 的孔計(jì)算病毒滴度，通過感染后的活細(xì)胞的數(shù)量來計(jì)算病毒滴度，測(cè)得最終滴度為5×108TU·mL-1。

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選

慢病毒在感染A549 細(xì)胞48 h 后，待細(xì)胞的融合率達(dá)到80%～90%，細(xì)胞進(jìn)行傳代，用嘌呤霉素繼續(xù)篩選。在倒置熒光顯微鏡下可觀察到A549 細(xì)胞持續(xù)表達(dá)綠色熒光，且細(xì)胞狀態(tài)良好，無明顯形態(tài)學(xué)變化（圖4）。

2.4 重組質(zhì)粒過表達(dá)效果的鑒定

根據(jù)ERK 及GAPDH Real-Time PCR 引物序列（表1），對(duì)嘌呤霉素篩選后的A549 細(xì)胞提取mRNA 和蛋白并進(jìn)行Real-time PCR 和Western blot 過表達(dá)效果驗(yàn)證。Western blot 蛋白條帶灰度分析結(jié)果顯示，過表達(dá)ERK 組A549 細(xì)胞中p-ERK、ERK 蛋白表達(dá)量均高于空載體組和空白組，且空載體組表達(dá)量略低于空白組（P均＜0.05），說明p-ERK、ERK 在A549 細(xì)胞中有過表達(dá)效果。見圖5A～B。Real-Time PCR 采用2-△△Ct法分析顯示，空白組和空載體組ERK mRNA 表達(dá)低于過表達(dá)ERK 組A549 細(xì)胞（P均＜0.05），空白組和空載體組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5C。

2.5 過表達(dá)ERK 對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞增殖能力的影響

CCK8 法檢測(cè)三組肺癌A549 細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)，三組不同肺癌細(xì)胞其增殖能力隨時(shí)間變化呈增高趨勢(shì)，與0 h 比較，24 h、48 h、72 h 后其增殖能力均升高，過表達(dá)ERK 組分別與空載體組、空白組相比，在24 h、48 h、72 h 的細(xì)胞增殖能力間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中過表達(dá)ERK 組高于空白組（P＜0.05），空白組和空載體組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示過表達(dá)ERK可增強(qiáng)肺癌A549 細(xì)胞增殖能力（圖6）。

2.6 過表達(dá)ERK 對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)ERK 組的細(xì)胞遷移率為（0.680±0.034）%，空載體組細(xì)胞遷移率為（0.450±0.032）%、空白組細(xì)胞遷移率為（0.430±0.030）%，三組細(xì)胞遷移率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=84.873，P＜0.05）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，其中過表達(dá)ERK 組高于空白組以及空載體組（P均＜0.05），空白組和空載體組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示過表達(dá)ERK 可增強(qiáng)肺癌A549 細(xì)胞遷移能力（圖7）。

2.7 過表達(dá)ERK 對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)ERK 組的平均穿膜細(xì)胞數(shù)較空載體組和空白組明顯增多，過表達(dá)ERK 組平均穿膜細(xì)胞數(shù)（215±2）個(gè)、空載體組平均穿膜細(xì)胞數(shù)為（87±5）個(gè)、空白組平均穿膜細(xì)胞數(shù)為（101±4）個(gè)，其中過表達(dá)ERK 組平均穿膜細(xì)胞數(shù)均多于空白組、空載體組（P均<0.05），空載體組少于空白組（P<0.05），提示過表達(dá)ERK可增強(qiáng)肺癌A549 細(xì)胞侵襲能力（圖8）。

2.8 Western blot 檢測(cè)ERK/JNK 蛋白表達(dá)

分別提取過表達(dá)ERK 組、空白組和空載體組A549 細(xì)胞的蛋白進(jìn)行電泳后對(duì)灰度值進(jìn)行比較，得出肺癌A549 細(xì)胞中過表達(dá)ERK 組p-90RSK、C-JUN、C-MYC、P-JNK、JNK 蛋白水平相較于空載體組和空白組發(fā)生上調(diào)（P均<0.05），提示ERK 過表達(dá)后對(duì)ERK/JNK 相關(guān)蛋白的表達(dá)也有影響（圖9）。

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路是細(xì)胞中主要的基本信息傳遞鏈[6]。將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，從而引發(fā)一系列細(xì)胞生理活動(dòng)，并參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡。迄今為止，在真核細(xì)胞中存在六種MAPK 信號(hào)通路，其中最主要的三條通路包括ERK/MAPK 信號(hào)通路、JNK 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和P38 信號(hào)通路，這三者共同影響著細(xì)胞的存活與凋亡[7]。

ERK 是ERK/MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的重要組分[8-9]，包括ERK1、ERK2 兩種亞型，兩者具有83%的氨基酸同一性，并且在所有組織中表達(dá)呈不同程度，在腦、骨骼肌、胸腺和心臟中具有特別高的水平[10]。 ERK 被多種生長(zhǎng)因子激活后，后續(xù)可進(jìn)一步通過受體酪氨酸激酶磷酸化激活Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)通路從而控制腫瘤細(xì)胞的一系列功能[6]。研究表明，生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的RAFMEK-ERK 通路與肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移密切相關(guān)，絲裂原刺激后，ERK 可被活性氧（ROS）、Ca2+激活，接受上游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)，將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到膜內(nèi)[11]，使細(xì)胞胞漿蛋白發(fā)生磷酸化，并且磷酸化一些核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子如C-FOS、CJUN、Elk-1、C-MYC 和ATF2 等，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。C-JUN、C-MYC 作為一種原癌基因，在血清，多種生長(zhǎng)因子刺激后，作用于胞核DNA 序列，引起DNA 合成發(fā)生變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生增殖[8]。核糖體S6 激酶（p90-RSK）是ERK/MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的下游組分，由ERK/MAPK 途徑激活，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，包括基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。在肺癌中，它與促進(jìn)肺癌細(xì)胞的存活密切相關(guān)，研究表明，RSK 的激活或過表達(dá)是通過促凋亡蛋白Bad 失活抑制細(xì)胞死亡[12]。

JNK 是MAPK 信號(hào)通路的重要分支，其在基因表達(dá)、細(xì)胞增殖等細(xì)胞調(diào)控方面具有重要作用。JNK 未激活時(shí)，主要存在于細(xì)胞胞漿中，部分存在于細(xì)胞核中；激活后，JNK 積聚于核內(nèi)，并激活下游基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等。目前許多實(shí)驗(yàn)都在腫瘤中可觀察到JNK 的活性增高，表明JNK 與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)聯(lián)，例如在非小細(xì)胞肺癌中藥物Diversin 通過激活Wnt/JNK 通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮上調(diào)作用[13]。另外，在化學(xué)物質(zhì)二乙基亞硝銨誘導(dǎo)的肝癌中，JNK 持久激活。而JNK1 基因敲除小鼠則對(duì)誘導(dǎo)的肝癌敏感性降低[14]。

通過驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)ERK 感染A549 細(xì)胞后ERK mRNA 和蛋白水平，說明成功構(gòu)建ERK過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并且C-JUN、C-MYC、p-90RSK在ERK 過表達(dá)后均出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，且CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)也說明過表達(dá)ERK 后，肺癌A549 增殖和侵襲能力增加，說明ERK 過表達(dá)后，肺癌細(xì)胞A549 的增殖、遷移、侵襲可能與ERK/JNK 信號(hào)通路有關(guān)。