袁 琳，代亞坤，高炳淼

(海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院/熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南 ?？?571199)

姜科植物在全世界約有52屬，1 500余種，分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]。常用的著名藥材為益智、砂仁、草豆蔻和紅豆蔻等，其中益智和砂仁為我國(guó)著名的四大南藥[2]。姜科植物中含有揮發(fā)油、黃酮類、甾體皂苷、雙苯庚烷類、萜類等多種化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)表明這些活性成分具有抗氧化、強(qiáng)心、抗癌、抗過敏、抗高血壓和提高免疫力等藥理活性[3-4]。近年來，由于過度采挖，導(dǎo)致其正常的繁殖方式、生長(zhǎng)環(huán)境遭到破壞，野生資源已日漸枯竭，引起了科研工作者對(duì)姜科資源研究的重視。通過對(duì)姜科資源進(jìn)行遺傳距離和聚類分析，可為其種質(zhì)資源鑒定和遺傳變異研究提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。因此，建立姜科資源遺傳多樣性的有效分析方法，對(duì)制定姜科資源的保護(hù)策略具有重要的意義[5]。

隨著遺傳分子科學(xué)的發(fā)展，基于PCR擴(kuò)增技術(shù)的各種分子標(biāo)記技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用[6-8]。但分子標(biāo)記技術(shù)的復(fù)雜性、穩(wěn)定性以及產(chǎn)生遺傳信息的能力各不相同，均有其優(yōu)缺點(diǎn)[5]。SRAP作為一種新型分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了RAPD和AFLP的優(yōu)點(diǎn)，高效、簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、共顯性強(qiáng)、重復(fù)性高且不受所測(cè)樣品生長(zhǎng)發(fā)育狀況、外界環(huán)境等眾多因素的影響[9]。該技術(shù)已成功地應(yīng)用于遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜和指紋圖譜的構(gòu)建及基因的克隆與定位[10-12]。目前，SRAP技術(shù)對(duì)姜科種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究力度不夠。為此，以海南島姜科植物為材料，運(yùn)用SRAP技術(shù)擴(kuò)增姜科植物的基因組獲得指紋圖譜，利用NTSYS-pc2.1和UPGMA分別分析其遺傳相似系數(shù)和構(gòu)建遺傳聚類樹圖，分析姜科植物種群間的遺傳多樣性，以期為姜科植物資源的保護(hù)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品材料 11種姜科植物樣品均在海南省?？谑兄袊?guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所(海南分所)南藥園圃采集(表1)。采集的新鮮姜科葉片放置在含硅膠的密封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃冰箱中保存。

表1 11種姜科植物樣品的來源信息

1.1.2 試劑 DNA Marker D2000、6×DNA loading buffer和植物基因組DNA提取試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；SRAP引物，由深圳華大基因科技有限公司合成；瓊脂糖(Biowest Agarose)，購(gòu)自海南合輝實(shí)業(yè)有限公司；核酸染料(Goidview)，購(gòu)自上海賽百盛公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 IBM型PCR擴(kuò)增儀，北京六一生物科技有限公司；HYQ-2110型微型渦旋混勻器，美國(guó)精騏有限公司；DYY-6D電泳儀電源，北京六一生物科技有限公司；核酸蛋白測(cè)定儀，德國(guó)Eppendorf公司；HH-3型恒溫水浴鍋，邦西儀器科技(上海)有限公司；HY-JX5L型SDS-電泳槽，北京六一生物科技有限公司；SIGMA 1-14微型離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；Tanon 4100凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒(Plant DNA Mini Kits)提取，得到的DNA樣品保存于-20℃，具體步驟參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行?；蚪MDNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)和凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及多態(tài)性分析 以姜科植物基因組DNA為模板，利用引物組合f8r1對(duì)11種姜科植物樣品進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增。SRAP-PCR反應(yīng)上游引物為sarp-f8：5′-TGA GTC CAA ACC GGA CT-3′；下游引物sarp-r1：5V-GAC TGC GTA CGA ATT AAT-3′[13]。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，第1個(gè)循環(huán)(94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min)循環(huán)5次；第2個(gè)循環(huán)(94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min)循環(huán)35次，72℃延伸1 min，4℃保存[13]。具體SRAP-PCR反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行操作。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)明亮清晰的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)不同樣本的條帶位點(diǎn)判斷其多態(tài)性。

記錄電泳圖譜上條帶的有無，條帶清晰的記為“1”，條帶模糊或缺失的記為“0”，轉(zhuǎn)換成0/1矩陣。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用NTSYS-pc2.1計(jì)算11種姜科藥用植物的遺傳相似系數(shù)，并采用UPGMA進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜科植物基因組提取

從圖1看出，姜科植物的DNA樣品條帶明顯清晰、未見降解。核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA樣品的A260/A280為1.60～1.86，說明樣品條帶中RNA和蛋白質(zhì)已基本剔除，DNA質(zhì)量良好，可以作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的模版。

注：M：Marker ; 1～3：益智；4～6：紅豆蔻；7～9：陽春砂；10～12：草豆蔻；13～15：高良姜；16～18：光葉山姜；19～21：爪哇白豆蔻；22～24：海南砂仁；25～27：陽荷；28～30：大苞閉鞘姜；31～33：皺葉山姜。

Note: M, Marker; 1-3,A.oxyphylla; 4-6,A.Willd; 7-9,A.villosum; 10-12,A.katsumadai; 13-15, A. officinarum; 16-18,A.intermedia; 19-21,A.compactum; 22-24,A.longiligular; 25-27,Z.strioatum; 28-30,C.megalobraecea; 31-33, A. rugosa.

圖1 11種姜科植物基因組DNA電泳圖

Fig.1 Genomic DNA electrophoresis of 11 species of Zingiberaceae

2.2 SRAP-PCR擴(kuò)增及多態(tài)性

從圖2可知，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在250～2 000 bp，部分條帶清晰明亮，大小合適，但也有部分條帶亮度較弱，不計(jì)入后期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。從表2可知，共獲得條帶59條，多態(tài)性條帶數(shù)為59條，多態(tài)性比率均為100%。

注：M：Marker ; 1～3：益智；4～6：紅豆蔻；7～9：陽春砂；10～12：草豆蔻；13～15：高良姜；16～18：光葉山姜；19～21：爪哇白豆蔻；22～24：海南砂仁；25～27：陽荷；28～30：大苞閉鞘姜；31～33：皺葉山姜。

Note: M, Marker; 1-3,A.oxyphylla; 4-6,A.Willd; 7-9,A.villosum; 10-12,A.katsumadai; 13-15, A. officinarum; 16-18,A.intermedia; 19-21,A.compactum; 22-24,A.longiligular; 25-27,Z.strioatum; 28-30,C.megalobraecea; 31-33, A. rugosa.

圖2 姜科植物的多態(tài)性擴(kuò)增電泳結(jié)果

Fig.2 Polymorphic amplification electrophoresis of Zingiberaceae

2.3 遺傳多樣性與聚類分析

從表3可知，11種姜科植物材料間的遺傳相似系數(shù)在0.500 0～0.838 4，表明11種姜科植物間具有豐富的遺傳多樣性，草豆蔻與大苞閉鞘姜、海南砂仁與皺葉山姜、紅豆蔻與光葉山姜、陽春砂與陽荷兩兩間遺傳相似系數(shù)最大，均為0.838 4，表明其親緣關(guān)系最近。紅豆蔻與草豆蔻的相似系數(shù)僅0.500 0，從形態(tài)學(xué)上看，二者親緣關(guān)系較近，但從相似系數(shù)上看，二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表2 11種姜科植物的SRAP擴(kuò)增數(shù)據(jù)

Table 2 SRAP amplification data of 11 species of Zingiberaceae

編號(hào)Number品種Variety總擴(kuò)增帶數(shù)/條Number of total amplified bands 多態(tài)性帶數(shù)/條Number of polymorphicbands多態(tài)性條帶比率/%Ratio of polymorphic band1益智331002紅豆蔻661003陽春砂11111004草豆蔻551005高良姜551006光葉山姜771007爪哇白豆蔻661008海南砂仁661009陽荷4410010大苞閉鞘姜2210011皺葉山姜44100

表3 11種姜科植物的遺傳系數(shù)

從圖3可知，在遺傳相似系數(shù)0.500 0處11種姜科藥用植物分為兩大類，Ⅰ類包括益智、草豆蔻、大苞閉鞘姜、海南砂仁和皺葉山姜，其親緣關(guān)系較近。Ⅰ類可劃分為5個(gè)亞類，在遺傳相似系數(shù)為0.591 0處，益智單獨(dú)聚為一類；在遺傳相似系數(shù)為0.838 4處，草豆蔻和大苞閉鞘姜分別單獨(dú)聚為一類，海南砂仁和皺葉山姜分別單獨(dú)聚為一類，表明其親緣關(guān)系很近，益智與草豆蔻和大苞閉鞘姜、益智與海南砂仁和皺葉山姜親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Ⅱ類包括紅豆蔻、光葉山姜、高良姜、陽春砂、陽荷和爪哇白豆蔻，其親緣關(guān)系較近。Ⅱ類可劃分為6個(gè)亞類，在遺傳相似系數(shù)為0.532 5處，爪哇白豆蔻單獨(dú)聚為一類，在遺傳相似系數(shù)為0.750 0處，高良姜單獨(dú)聚為一類，在遺傳相似系數(shù)為0.838 4處，紅豆蔻與光葉山姜、陽春砂與陽荷分別單獨(dú)聚為一類，表明其親緣關(guān)系很近。

注：1為益智，2為紅豆蔻，3為陽春砂，4為草豆蔻，5為高良姜，6為光葉山姜，7為爪哇白豆蔻，8為海南砂仁，9為陽荷，10為大苞閉鞘姜，11為皺葉山姜。

Note: 1,A.oxyphylla; 2,A.Willd; 3,A.villosum; 4,A.katsumadai; 5,A.officinarum; 6,A.intermedia; 7,A.compactum; 8,A.longiligulare; 9,Z.strioatum; 10,C.striolatum; 11,A.rugosa.

圖3 11種姜科植物的UPGMA聚類

Fig.3 UPGMA clustering of 11 species of Zingiberaceae

3 結(jié)論與討論

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)整合了RFLP、RAPD、SSR和AFLP的優(yōu)點(diǎn)，具有操作過程簡(jiǎn)單、擴(kuò)增條帶清晰、結(jié)果穩(wěn)定和重復(fù)性高等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于鐵皮石斛[14]、梔子[15]、紅花[16]、野生兜蘭[17]、石斛蘭[18]和海南降香黃檀[19]等遺傳多樣性研究。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于姜科植物的研究相對(duì)較少。SRAP分子標(biāo)記可有效用于姜科藥用植物的遺傳差異分析及物種鑒別，并利用SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行姜科各屬內(nèi)及屬間分類和親緣關(guān)系分析[20-21]。課題組前期研究?jī)?yōu)化了姜科益智的SRAP-PCR體系[13]，選擇已篩選引物f8r1對(duì)姜科資源進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記分析，以期從分子水平確定姜科種質(zhì)資源親緣關(guān)系，為姜科品種鑒定、品種保護(hù)提供理論依據(jù)，進(jìn)而推動(dòng)姜科資源更深層的開發(fā)利用。

研究結(jié)果表明，引物f8r1對(duì)姜科植物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了條帶豐富且清晰的電泳圖譜，多態(tài)率均為100%，說明SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在姜科資源的遺傳多樣性研究中有很高的檢出率。因此，SRAP分子技術(shù)能很好的用于姜科植物物種間的遺傳多樣性分析[21]。UPGMA聚類分析表明，海南姜科植物資源具有豐富的遺傳多樣性。11種姜科植物分別為山姜屬6種，豆蔻屬3種，姜屬和閉鞘姜屬分別各1種。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)將11種姜科植物主要分為兩大類，Ⅰ類可以劃分為5個(gè)亞類：益智、草豆蔻、大苞閉鞘姜、海南砂仁和皺葉山姜。Ⅱ類可劃分為6個(gè)亞類，爪哇白豆蔻、高良姜、紅豆蔻、光葉山姜、陽春砂和陽荷。山姜屬的紅豆蔻、光葉山姜和高良姜親緣關(guān)系很近，與傳統(tǒng)分類結(jié)果一致。但山姜屬的益智、草豆蔻、紅豆蔻和皺葉山姜之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明山姜屬內(nèi)姜科植物同樣具有豐富的遺傳多樣性。豆蔻屬的海南砂仁、陽春砂和爪哇白豆蔻之間的聚類結(jié)果親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而陽春砂與姜屬的陽荷親緣關(guān)系較近，海南砂仁與閉鞘姜屬的大苞閉鞘姜親緣關(guān)系最近。高麗霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，采用SRAP分子標(biāo)記分析姜花屬植物系統(tǒng)分類中與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)之間存在差異。

研究以引物f8r1對(duì)姜科植物進(jìn)行SRAP分析，構(gòu)建了姜科植物的遺傳聚類圖譜，并分析了其遺傳多樣性，結(jié)果表明，姜科植物提取的DNA條帶明顯清晰、未見降解、質(zhì)量良好。SRAP-PCR擴(kuò)增共獲得條帶59條，均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率均為100%。姜科植物的遺傳相似系數(shù)為0.500 0～0.838 4，其中草豆蔻與大苞閉鞘姜、海南砂仁與皺葉山姜、紅豆蔻與光葉山姜、陽春砂與陽荷兩兩間遺傳相似系數(shù)最大，均為0.838 4，表明其親緣關(guān)系最近。在遺傳相似系數(shù)0.500 0處，11種姜科藥用植物分為兩大類，Ⅰ類包括益智、草豆蔻、大苞閉鞘姜、海南砂仁和皺葉山姜。Ⅱ類包括紅豆蔻、光葉山姜、高良姜、陽春砂、陽荷和爪哇白豆蔻。