鄧小鋒，陳滿靜，曹紹書，譚金玉，陳柔屹，程 江，周棱波，鄭常祥

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 旱糧研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物品種資源研究所，貴州 貴陽 550006)

高粱〔Sorghumbicolor(L.) Moench〕是世界第五大作物，種植面積僅次于小麥、玉米、水稻和大麥，廣泛用于飼料、糧食、釀造加工和能源等行業(yè)[1]。高粱籽粒營(yíng)養(yǎng)成分豐富，其中含粗淀粉約75%，粗蛋白11%，脂肪3%，纖維2.5%～4%，與玉米飼用能效相當(dāng)[2-3]。淀粉是植物光合產(chǎn)物碳水化合物的主要儲(chǔ)存形式。根據(jù)不同生物學(xué)功能，植物淀粉分為過渡型淀粉和貯藏型淀粉。過渡型淀粉白天在光合組織中積累，晚上降解后為植物生長(zhǎng)代謝提供物質(zhì)與能量[4]，貯藏型淀粉儲(chǔ)存于植物種子胚乳及塊莖中，為發(fā)芽和再生提供能量[5]。禾本科植物胚乳中的淀粉粒由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其合成和積累在造粉體中進(jìn)行。右旋葡萄糖通過α-1,4糖苷鍵形成100～10 000個(gè)殘基的線性葡聚糖鏈，其上分布有極少量的α-1,6糖苷鍵，其多糖為直鏈淀粉。若在10 000～100 000個(gè)殘基的葡聚糖鏈上大量且規(guī)律分布著由α-1,6糖苷鍵形成的支鏈，其多糖為支鏈淀粉[6]。支鏈淀粉形成非定形晶狀體薄片結(jié)構(gòu)，直鏈淀粉的線性支鏈分布于支鏈淀粉間，使淀粉粒呈半晶體狀[7]。

胚乳淀粉粒的合成是一個(gè)復(fù)雜而高度調(diào)控的過程，從1-磷酸葡萄糖進(jìn)入造粉體后，至少涉及腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose Pyrophosphorylase，AGPase)、淀粉合成酶(Starch Synthase，SS)、淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme，SBE)和淀粉去分支酶(Starch Debranching Enzyme，DBE)4種酶的參與[6]。淀粉合成酶的功能是將底物腺苷二磷酸葡萄糖(Adenosine Diphosphate-glucose，ADPG)轉(zhuǎn)移到葡聚糖鏈的非還原端，使葡聚糖鏈不斷延伸。根據(jù)功能的不同又分為顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(Granule-Bound Starch Synthase，GBSS)和可溶性淀粉合成酶(Soluble Starch Synthases，SS)[8]。顆粒結(jié)合型淀粉合成酶負(fù)責(zé)直鏈淀粉和支鏈淀粉特長(zhǎng)鏈的合成，可溶性淀粉合成酶主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉的合成。完整規(guī)則的高粱胚乳支鏈淀粉約占淀粉總量的70%～80%，直鏈淀粉約占總量的20%～30%[9-10]。

當(dāng)高粱基因GBSS的功能缺失或者削弱后，籽粒胚乳呈糯質(zhì)性狀，也叫蠟質(zhì)性狀，胚乳中幾乎無法合成直鏈淀粉，全是支鏈淀粉。典型的糯質(zhì)胚乳縱切面是灰白色的光滑面，如同蠟燭的蠟或白玉的表面。一些糯質(zhì)高粱的整個(gè)胚乳區(qū)域都呈蠟質(zhì)狀；一些糯質(zhì)高粱的胚乳與胚的交界處有條狀白色粉質(zhì)區(qū)，其他區(qū)域?yàn)橄炠|(zhì)狀；一些糯高粱胚乳中心有小的白色粉質(zhì)區(qū)，周圍是蠟質(zhì)性狀。由于形成蠟質(zhì)性狀，GBSS在早期被命名為Wx基因(Waxy,Wx)[11]。典型的粳高粱籽粒整個(gè)胚乳區(qū)呈白色粉質(zhì)的粗糙面。一些高粱材料的籽粒由于胚乳的淀粉粒與蛋白質(zhì)基質(zhì)結(jié)合緊密，在外周胚乳形成了晶體狀的角質(zhì)[12]，角質(zhì)性狀在谷類作物籽粒普遍存在[13]，隱性的wx基因存在劑量效應(yīng)。

從多種谷類作物都發(fā)現(xiàn)糯質(zhì)突變體。玉米的AC或DS轉(zhuǎn)座元件插入GBSSI基因中，使其不能正常翻譯，形成糯質(zhì)性狀[14]。糯質(zhì)水稻的GBSSI第一個(gè)內(nèi)含子的5′剪接位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，只能形成3.3 kb的未成熟mRNA，無法正常翻譯[15]。從云南的地方水稻品種中發(fā)現(xiàn)，GBSSI的497號(hào)堿基發(fā)生突變，使GBSSI與淀粉顆粒的結(jié)合度降低，形成另一類型的糯質(zhì)性狀[16]。普通小麥含有3個(gè)GBSSI，分別為Wx-A1b，Wx-B1b和Wx-D1b。糯質(zhì)小麥中，Wx-A1b編碼區(qū)完全缺失，Wx-B1b和Wx-D1b編碼區(qū)序列缺失一部分[17]。大麥中，GBSSI編碼區(qū)上游啟動(dòng)子序列缺失降低了該基因的轉(zhuǎn)錄效率，同時(shí)GBSSI編碼區(qū)的1個(gè)堿基錯(cuò)義突變，改變了該酶的保守結(jié)構(gòu)域，使GBSSI完全失去功能[18]。

已知高粱的GBSSI有4種突變基因型。wxa的第3外顯子處插入了約4kb的轉(zhuǎn)座序列，wxb的一個(gè)堿基C突變?yōu)門，保守結(jié)構(gòu)域的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸，使GBSSI活性降低[19]。wxa不能翻譯成酶GBSSI，胚乳完全不能合成直鏈淀粉。wxb的GBSSI酶活性只有正常的75%。四川糯高粱分析鑒定出基因型wxc和wxd[20]。兩者由于在第9外顯子和第11外顯子剪接處發(fā)生堿基缺失或者突變，造成編碼框改變，翻譯后的酶缺乏正常的功能。貴州糯高粱的wx基因型的分析研究已有報(bào)道[21]，但其針對(duì)的是糯高粱品種，且數(shù)量非常少。鮮見關(guān)于貴州省糯高粱基礎(chǔ)資源鑒定的相關(guān)研究報(bào)道。為此，對(duì)前期工作中已經(jīng)搜集的一批貴州地方高粱資源(包括地方種、農(nóng)家種和野生高粱)進(jìn)行糯質(zhì)高粱的wx基因型鑒定，以期為貴州地方高粱資源在育種中應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

高粱材料：用于糯質(zhì)分析的高粱材料(貴州地方種、農(nóng)家種和野生高粱)共計(jì)252份，前期工作中搜集。其中，貴州省資源226份，省外資源20份，育種中間材料5份，貴州地方品種1份。

1.2 方法

1.2.1 胚乳性狀的鑒定 收集的基礎(chǔ)資源中，許多材料的wx等位基因?yàn)殡s合狀態(tài)，包括不同基因型及某種基因型在胚乳的不同拷貝數(shù)。通過快速鑒定籽粒胚乳的剖面性狀來確定糯質(zhì)材料。每份材料隨機(jī)選8～10顆飽滿籽粒，經(jīng)縱切后進(jìn)行剖面觀察鑒定，不同胚乳性狀分別用數(shù)字1、2、3和4進(jìn)行標(biāo)識(shí)。

數(shù)字1：籽粒整個(gè)胚乳區(qū)呈灰白色不透明蠟質(zhì)狀；胚乳與胚的交界處有細(xì)小條狀粉質(zhì)區(qū)，其余區(qū)域?yàn)橄炠|(zhì)狀；胚乳中心有細(xì)小的白色粉質(zhì)區(qū)，周圍是蠟質(zhì)狀；整個(gè)胚乳區(qū)呈更白的不透明蠟質(zhì)狀。

數(shù)字2：從胚至種子頂端有一條白色粉質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域最多約占胚乳面積的1/2，其余部分呈蠟質(zhì)狀。若某材料的4～5顆籽粒呈前述蠟質(zhì)胚乳，該材料將用于基因型鑒定。材料角質(zhì)性狀通過觀察相同縱切剖面進(jìn)行鑒定，并記載角質(zhì)占剖面的面積。

數(shù)字3：角質(zhì)胚乳。

數(shù)字4：完全粉質(zhì)胚乳。

1.2.2 DNA提取 共鑒定出121份糯質(zhì)胚乳材料，其中100份材料用于后續(xù)wx基因型鑒定，2份角質(zhì)胚乳材料作為對(duì)照。100份材料中包括基礎(chǔ)材料94份，中間材料5份，貴州品種紅纓子作為比較材料。每份材料約20粒種子播于發(fā)苗盤，各材料在3葉期時(shí)取5～8個(gè)單株的葉片進(jìn)行混合。DNA提取采用改良CTAB法：約0.2 g混合葉片，放入1.5 mL PE離心管，加入液氮，用轉(zhuǎn)槍研磨成粉末。每管加入預(yù)熱的提取緩沖液500 μL，在65℃溫浴1 h，每間隔10 min溫和混勻1次。以10 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管。每管加入8 μL的RNAse A(10 mg/mL)，37℃溫浴20 min。短暫離心，加入500 μL氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，輕輕顛倒混勻10～15 min，直到混液呈白色乳濁狀。12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管，再加入500 μL的氯仿∶異戊醇混合液，重復(fù)以上操作1次。沉淀DNA時(shí)，加入適量5 M/L NaAc溶液，混勻后加入2倍體積4℃預(yù)冷的95%乙醇溶液，-20℃放置1 h，于低溫10 000 r/min離心10 min，吸出上液，加入預(yù)冷的75%乙醇洗滌，10 000 r/min離心5 min，吸出上液。再重復(fù)洗滌1次。10 000 r/min離心1 min后，吸出殘留乙醇，敞開管蓋置于干凈環(huán)境10～15 min，隨后每管加入100 μL ddH2O，DNA充分溶解后，用微量分光光度計(jì)和瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。緩沖液提?。?00 mM Tris-HCL(pH 7.5)，25 mM EDTA，1.5 M NaCl，2%(w/v)CTAB。0.3%(v/v)β-mercaptoethanol，在緩沖液預(yù)熱前加入。

1.2.3wxa基因型的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[19]的方法合成引物，引物序列(5′～3′)：Wxa-F，CGTGGCGAGATCAAACTCTA;Wx-F,GGCCTGGATTCAATGTTCTT；Wx-R，CTGGTTGTCCTTGTAGTCCGTT； PCR體系共25 μL：ddH2O 13.25 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 0.75 μL，DNA 2 μL，Pfu酶0.5 μL。 PCR程序：98℃預(yù)熱1 min，98℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 1 min 2 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，4℃冷置。產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中120 V電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，標(biāo)記Marker為 Marker J。

1.2.4 檢測(cè)wxb基因型 根據(jù)Sattler方法合成引物[19]，引物序列(5′～3′)：Wxb-F，CGACCGTGTGTTCATTGACCAC；Wxb-R TTGTTCAGTGCCTTTGCCTCG。PCR體系共25 μL：ddH2O 14 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 3 μL，Pfu酶0.5 μL。PCR程序：98℃預(yù)熱1 min，98℃ 30 s，54.6℃ 30 s，72℃ 2 min 34 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，4℃冷置。標(biāo)記Marker為 Marker J。

1.2.5 檢測(cè)wxc基因型 參照文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行改動(dòng)，為提高PCR擴(kuò)增效率，重新設(shè)計(jì)引物。引物序列(5′～3′)：Wxc-F，TCGTCAACGGCATGGACGTCAGCGAG；Wxc-R，GCCGGCCATGATGTGGTGTGCCAG。PCR體系共25 μL：ddH2O 14 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 3 μL，Pfu酶0.5 μL。PCR程序：98℃預(yù)熱1 min，98℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 1 min 4 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，4℃冷置。PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系 20 μL：ddH2O，13.5 μL，10×buffer B 2 μL，PCR DNA 4 μL，HphI 5 U。37℃溫浴16 h，于3%瓊脂糖凝膠中120V電泳1 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照。標(biāo)記Marker為 Marker J。

1.2.6 檢測(cè)wxd基因型 參照文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行改動(dòng)，為提高PCR擴(kuò)增效率，重新設(shè)計(jì)了PCR引物。引物序列(5′～3′)：Wxd-F，CGCTGCTCATGGAGGAGGACATACAGATCGTT,Wxd-R,AGGGCTCGAAGCGGCTGGTGACGG。PCR體系共25 μL：ddH2O 14 μL，10×buffer 2.5 μL，引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 3 μL，Pfu酶0.5 μL。PCR程序：98℃預(yù)熱1 min，98℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 33s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，4℃冷置。PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系 20 μL：ddH2O 11.5 μL，10×buffer SduI 2 μL，PCR DNA 6 μL，SduI 5 U。酶切在37℃溫浴16 h，于3%的瓊脂糖凝膠中120 V電泳1 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照。標(biāo)記Marker為 Marker A。

2 結(jié)果與分析

2.1 102份高粱材料的胚乳性狀

標(biāo)記為1的材料蠟質(zhì)化程度高于標(biāo)記為2的材料，3為角質(zhì)籽粒，4為粉質(zhì)籽粒。從表1可知，D58和E48(對(duì)照)籽粒的剖面性狀分別為3(4/5)和3(5/6)。其余100份高粱材料中，籽粒剖面性狀標(biāo)記為1的有D1、E3和E40等11個(gè)材料，標(biāo)記為2的有A5、B19和B37等45個(gè)材料，標(biāo)記為2、1或1、2的有B11、B45和C20等30個(gè)材料，標(biāo)記為2、1、3或3、1、2的有D91和E52，標(biāo)記為1、2、4或2、4、1的有E26、A13和F19等5個(gè)材料，標(biāo)記為2、4的有F29，標(biāo)記為3、2或2、3的有A25、F40和F13等4個(gè)材料?？梢姡S多糯質(zhì)高粱材料之間籽粒蠟質(zhì)化程度及多份材料內(nèi)部的籽粒蠟質(zhì)化程度均不同，揭示許多材料含有雜合的wx基因型，還含有野生型Wx，同時(shí)許多材料籽粒間糯質(zhì)基因型的拷貝數(shù)不同，形成了籽粒蠟質(zhì)化程度的多樣性。

表1 102份高粱材料籽粒的胚乳性狀

注：從鑒定的糯質(zhì)胚乳材料中選擇100份進(jìn)行wx基因型分析，角質(zhì)胚乳材料D58和E48為對(duì)照；括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)表示角質(zhì)占剖面的面積。

Note:wxgenotype of 100 accessions selected from indentified glutinous endosperm accessions is analyzed. D58 and E48 of keratin endosperm are as the control. The data in bracket means the area of keratin in section.

2.2 不同基因型的檢測(cè)

2.2.1wxa基因 在102份材料中，若PCR產(chǎn)物含611 bp條帶即為wxa基因型，含519 bp條帶為非wxa基因型。從圖1看出，基因型為純合wxa的材料有68份，基因型為非wxa的材料有23份，含有雙帶基因型的雜合材料有11份。23份非wxa材料和11份含有雙帶基因型的雜合材料共計(jì)34份材料用于后續(xù)wxb、wxc基因型的檢測(cè)。

注：M為Marker(下同)；D85鑒定2次。

Note:M, Marker (the same below); D85 tested twice.

圖1 102份材料wxa基因型的檢測(cè)結(jié)果

Fig.1 Detection result ofwxagenotype in 102 accessions

2.2.2wxb基因型 從圖2看出，在14份材料中，擴(kuò)增產(chǎn)物中包含1 282 bp的目標(biāo)條帶，但也包含約350 bp的雜帶1條，且雜帶的亮度高于目標(biāo)條帶。因此，Sattler方法的引物無法用于檢測(cè)14份高粱材料的wxb基因型，需要重新設(shè)計(jì)特異性引物。

2.2.3wxc基因型 若PCR產(chǎn)物為529 bp單條帶即為wxc基因型。產(chǎn)物被HphI酶切為452 bp和77 bp的材料為非wxc基因型。從圖3可知，基因型為純合wxc的材料有8份，基因型為非wxc的材料有11份，含有3條條帶的雜合材料基因型有15份。結(jié)合wxa基因型的檢測(cè)結(jié)果，11份非wxc材料中，同時(shí)含有wxa基因型和未鑒定基因型的材料為B46、C17和E52，其他8份材料的基因型為非wxa和非wxc。15份雜合材料中，B19等7個(gè)材料不含wxa，除含有wxc外，還含有野生型或未鑒定的基因型。B30等8個(gè)材料含有wxa和wxc，但可能還含有野生型等其他基因型。15份雜合材料和11份非wxc材料用于后續(xù)wxd基因型的檢測(cè)。

2.2.4wxd基因型wxd基因型檢測(cè)中，若PCR產(chǎn)物不能被SduI酶切為269 bp單條帶的材料為wxd基因型，產(chǎn)物被酶切為148 bp、115 bp和6 bp的材料為非wxd基因型，6 bp片段由于長(zhǎng)度短，電泳過程中析出凝膠外，在檢測(cè)時(shí)不可見。含有3條條帶的材料為雜合型。從圖4看出，基因型為純合wxd的材料有6份，基因型為非wxd的材料有18份，基因型為wxd和其他基因型的雜合材料有2份。結(jié)合材料wxa和wxc基因型的檢測(cè)結(jié)果，確定雜合材料B19含wxc和wxd基因型，B46含wxa和wxd基因型。非wxd的18份材料中，B30、D86、E9、II137、E7、F31和E40是wxa和wxc基因型；B17除含wxa和wxc基因型外，可能還含有野生型等其他基因型；C17和E52含wxa和野生型等其他基因型；B45、A25、F29、C27、F19和F15含wxc和野生型等其他基因型；D58和E48不含wxa、wxc及wxd基因型。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，100份糯質(zhì)材料通過wxa、wxc和wxd基因型的檢測(cè)，GBSSI位點(diǎn)為純合wxa的材料有68份，純合wxc的材料有8份，純合wxd的材料有6份；位點(diǎn)包含2種糯質(zhì)基因型的材料有9份。其余9份材料中，8份材料除含1種糯質(zhì)基因型外，還含有野生型等未鑒定基因型；1份材料除2種糯質(zhì)基因型外，可能還含有野生型等未鑒定的基因型。D58和E48不含wxa、wxc及wxd基因型。研究發(fā)現(xiàn)，wxb鑒定方法不成熟，未進(jìn)行wxb的鑒定。

研究結(jié)合籽粒剖面蠟質(zhì)鑒定方法和3種wx基因型分子鑒定方法，在不測(cè)量籽粒支鏈淀粉含量的前提下，快速分析高粱糯質(zhì)資源的wx基因型，為后續(xù)研究和應(yīng)用提供有用信息。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分材料的籽粒剖面鑒定結(jié)果與分子鑒定結(jié)果間有偏差。如PCR鑒定出純合wxa的材料68份，無Wx野生型，但在籽粒剖面性狀鑒定中，B5和B41等部分材料的蠟質(zhì)標(biāo)識(shí)為2，即在檢測(cè)的8粒籽粒中，縱切剖面胚乳區(qū)域含有1條白色粉質(zhì)區(qū)。預(yù)示這些材料除含wxa外，還含Wx野生型。推測(cè)偏差原因：一是進(jìn)行剖面蠟質(zhì)性狀鑒定和PCR分子鑒定的籽粒為同1份材料的不同籽粒。研究中的糯質(zhì)高粱來自農(nóng)家種和地方栽培種等，同1份材料的不同籽粒間糯質(zhì)性狀有差異。二是部分糯質(zhì)材料的Wx野生型量遠(yuǎn)少于wxa基因型量，由于PCR過程中 3種引物添加到同一反應(yīng)體系中，Wx野生型模板無法擴(kuò)增出足夠的量顯示出來。在后續(xù)試驗(yàn)中，一是改縱切為橫切，完成籽粒剖面性狀的鑒定后，將含有胚的部分進(jìn)行發(fā)芽，其DNA用于分子鑒定，性狀鑒定和分子鑒定的結(jié)果將更一致。二是在wxa基因型檢測(cè)中，2種反向引物分別添加到不同PCR體系，通過擴(kuò)增微量模板，提高鑒定的靈敏度。

在后續(xù)研究中，需進(jìn)一步鑒定4種wx糯質(zhì)基因型籽粒中不同wx基因拷貝數(shù)下籽粒剖面的性狀差異。wxa基因型無法合成有活性的GBSSI酶，wxb合成的酶活性約為野生型的20%，未見wxc和wxdGBSSI酶活性的研究報(bào)道[19]。4種wx基因型間及同種wx基因型的不同拷貝數(shù)間，籽粒剖面性狀、支鏈淀粉含量均存在差異。鑒定wxb基因型時(shí)發(fā)現(xiàn)，SATTLER等[19]報(bào)道的引物特異性不高。因此，需要重新設(shè)計(jì)特異引物。研究反映出搜集的高粱糯質(zhì)資源材料的等位基因較豐富，在后續(xù)繁種保存過程中，需多株繁種，防止有益等位基因的丟失。