臧靈飛，張洪玲，楊 迪，2，趙鵬宇，趙昶靈*，李桂瓊，古朝山，張 優(yōu)，顧 凡，陳杞臨

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100； 3.上海理工大學(xué) 環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093)

轉(zhuǎn)錄因子基因(transcription factor gene, TF)是高等植物三萜皂苷生物合成的調(diào)節(jié)基因之一，但高等植物三萜皂苷合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)迄今不完全清楚；三七〔Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen〕的所有器官均能合成三七最關(guān)鍵的藥理活性成分三萜皂苷，目前初步認(rèn)為，參與三七三萜皂苷合成的轉(zhuǎn)錄因子主要包括堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix, bHLH)、乙烯響應(yīng)因子(ethylene response factor, ERF)、v-myb骨髓母細(xì)胞增多癥病毒癌基因同源物(v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)和WRKY蛋白(WRKY protein)[1-5]。這4種轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的組成不同。bHLH的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于N端的第145～190個(gè)氨基酸殘基間[6]；ERF的位于第75～134個(gè)氨基酸殘基間[7]；MYB的N端由1～3個(gè)串聯(lián)的、不完全重復(fù)的R結(jié)構(gòu)(即：R1、R2和R3)組成，R結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基以螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)的形式參與結(jié)合DNA，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于第7～66個(gè)氨基酸殘基間[8]；WRKY蛋白含高度保守的、位于第188～244個(gè)氨基酸殘基間的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的核心序列是靠近N端的、具DNA結(jié)合活性的7個(gè)保守氨基酸殘基(即：WRKYGQK)[9]。

一年生三七植株的綠紫(過渡地上)莖因花色苷在莖上部的局部積累而表現(xiàn)出黃金分割式紫化[10]；研究表明，三七地上莖的三萜皂苷主要是人參皂苷Rb1[11-12]，而在三七綠紫莖中，總花色苷含量與總?cè)圃碥蘸?total triterpenoid saponin content, TTSC)之間呈極顯著負(fù)相關(guān)[12]。但是，關(guān)于bHLH、ERF、MYB和WRKY對三七綠紫莖三萜皂苷合成的差異性調(diào)控貢獻(xiàn)鮮見報(bào)道。因此，對三七綠紫莖中三七堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白基因(basic helix-loop-helix gene,bHLH)、乙烯響應(yīng)因子基因(ethylene response factor gene,ERF)、v-myb骨髓母細(xì)胞增多癥病毒癌基因同源物基因(v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog gene,MYB)和WRKY1蛋白基因(WRKY protein gene,WRKY1)轉(zhuǎn)錄水平的縱向變化及其與TTSC間的相關(guān)性進(jìn)行研究，旨在探明這4種轉(zhuǎn)錄因子基因(transcription factor gene, TF)對綠紫莖三萜皂苷合成的差異性貢獻(xiàn)，以揭示綠紫莖中三萜皂苷合成相關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子，為三七綠紫莖三萜皂苷合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試材：一年生三七綠紫莖植株(平均株高約18 cm)于2017年和2018年12月隨機(jī)采集于云南省文山州硯山縣盤龍鄉(xiāng)的苗鄉(xiāng)三七科技有限公司(23°31′48″N，104°19′21″E，海拔1 540 m)。三七為壟作，壟寬150 cm、高30 cm，壟溝寬30 cm；棚頂和棚四周覆2層黑色聚乙烯遮陽網(wǎng)[13]；植株的采集與預(yù)處理按文獻(xiàn)[13-14]進(jìn)行，2017年和2018年分別采集80株，將莖均分為18段，將相應(yīng)莖段混合、加液氮研磨成粉，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：乙醇，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；冰醋酸，購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；香草醛，購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；高氯酸，購自江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；EASYspin Plus Plant RNA Kit，購自北京艾德萊生物科技有限公司；TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)和TransScript?Top Green qPCR Supermix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SanPerp柱式DNA膠回收試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。對照品，人參皂苷Rgl，購自上海源葉生物科技有限公司。

儀器：高速冷凍離心機(jī)(HC-3018R型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，紫外-可見分光光度計(jì)〔Agilent Cary 60型，為安捷倫科技(中國)有限公司產(chǎn)品〕，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 方法

1.2.1 三七綠紫莖莖段中bHLH、ERF、MYB和WRKY1轉(zhuǎn)錄水平的檢測

1) 莖段總RNA的提取和cDNA一鏈的合成。用EASYspin Plus Plant RNA Kit提取莖段總RNA，檢測RNA提取液的OD260和OD280，以評價(jià)RNA的純度和得率，RNA的完整性則用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；cDNA一鏈用TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)合成[14]。

2) 三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1特征片段擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)及其適合性評價(jià)。借助Primer 6.0，擴(kuò)增三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1特征片段的引物分別基于bHLH、ERF、MYB和WRKY的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)，依托的堿基序列分別為竹節(jié)參(Panaxjaponicas)bHLH1的全長(登錄號：ALB38667.1)等、竹節(jié)參(P.japonicas)ERF1的全長(登錄號：ALB38666.1)等、人參(Panaxginseng)MYB1的全長(登錄號：APU53711.1)等以及三七(P.notoginseng)WRKY1(即：PnWRKY1)(登錄號：AJG43747.1)的全長；此外，擴(kuò)增內(nèi)參基因三七甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene, GAPDH)特征片段的引物來自文獻(xiàn)[15](表1)。然后，以cDNA一鏈為模板，以設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增子用1%的瓊脂糖電泳檢測(電壓120 V，電流130 mA，時(shí)間25 min)，同時(shí)進(jìn)行膠回收后送昆明碩擎生物科技有限公司測序；據(jù)擴(kuò)增子的大小和堿基序列與bHLH、MYB、ERF和WRKY的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的堿基序列的相似程度來評價(jià)引物的合適性。

3) 莖段中bHLH、ERF、MYB和WRKY1轉(zhuǎn)錄水平的檢測。莖段中三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1的轉(zhuǎn)錄水平用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測，以cDNA一鏈為模板、以三七GAPDH為內(nèi)參，據(jù)文獻(xiàn)[14]，按試劑盒TransStart?Top Green qPCR Supermix的說明完成。

表1 三七bHLH、ERF、MYB、WRKY1和GAPDH特征片段擴(kuò)增的引物

Table 1 Primers used to amplify the characteristic fragments of thebHLH,ERF,MYB,WRKY1 and GAPDH ofP.notoginseng

基因Gene引物(5′→3′)Primer正向引物反向引物退火溫度/℃Annealing temperature擴(kuò)增子大小/bpAmplicon sizebHLHGCTTCTCAAGGTGCTAAGAACAGATTCCGTGGACTTC58.2217ERFGTGGAGTACCTCTCGGAAGCAGTCCTCATTTGGGAA56.0200MYBATGAAGGAGCGACAGAGGAGCGTTCAAGGCAGGATT56.5126WRKY1ACAGTGGAGATTAGAAGAGTCGTATGTCAGACTAGCA58.0181GAPDHGTGTTCACTCTATCACTGCCACTCGCTTTCCCTCTGACTCCTCC55.0279

注：退火溫度由PCR確定，擴(kuò)增子大小由昆明碩擎生物科技有限公司預(yù)測.

Note:The annealing temperatures were determined by the PCRs and the amplicon sizes were predicted by Kunming Shuoqing Biotechnology Co.

1.2.2 三七綠紫莖莖段總?cè)圃碥蘸康臋z測 莖段的總?cè)圃碥蘸?TTSC)用“香草醛-高氯酸比色法”檢測，參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行測定并略作修改，稱莖段粉0.100 g；在60℃水浴加熱15 min后放入冰水浴中2 min。試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010作圖；SPSS 25.0進(jìn)行方差分析和雙因素相關(guān)性分析；用“百邁客云”的在線工具(https://international.biocloud.net/zh/software/ tools/heatmap/-1/-1)繪制轉(zhuǎn)錄水平的熱圖[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七綠紫莖莖段總RNA的質(zhì)量特征

從圖1看出，提取的三七綠紫莖莖段總RNA在1%瓊脂糖凝膠電泳時(shí)顯示28 S和18 SrRNA清晰條帶，亮度基本均勻；RNA的得率為10.480～13.440 μg/g，OD260/OD280為1.805～2.151。

注：M為Marker，1～18為莖從頂部向基部被均分為18段。

Note: M，Marker；1～18 indicated that the stems were evenly divided into 18 segments from the tops to the bases.

圖1三七綠紫莖莖段總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜

Fig.1 1% agarose gel electrophoretogram of the total RNAs extracted from the segments of the purplish-green stems ofP.notoginseng

2.2 三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1特征片段擴(kuò)增引物的適宜性

用于擴(kuò)增三七bHLH、ERF、MYB、WRKY1和GAPDH特征片段的引物以cDNA一鏈為模板進(jìn)行PCR時(shí)，擴(kuò)增子分別為217 bp、200 bp、126 bp、181 bp和279 bp，均與理論預(yù)測值相符；在1%瓊脂糖電泳圖上，所有擴(kuò)增子均表現(xiàn)為清晰的單一條帶(圖2)；4種擴(kuò)增子的堿基序列分別與設(shè)計(jì)引物時(shí)依托的竹節(jié)參(P.japonicas)bHLH1(登錄號：ALB38667.1)、竹節(jié)參(P.japonicas)ERF1(登錄號：ALB38666.1)、人參(P.ginseng)MYB1(登錄號：APU53711.1)和PnWRKY1(登錄號：AJG43747.1)的堿基序列擁有86.38%、93.03%、88.98%和98.36%的相似度，且均定位于4種TF DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)內(nèi)。在qRT-PCR中，4種TF的擴(kuò)增曲線均呈平滑的S形，循環(huán)閾值為22～30，且溶解曲線都具單一峰。

M為DNA marker(2 kb)，B、E、M、W和G分別為bHLH、ERF、MYB、WRKY1和GAPDH，1和2為重復(fù)次數(shù)。

Note:M,DNA marker(2 kb). B, E, M, W and G represented the bHLH, ERF, MYB, WRKY1, and GAPDH, respectively. 1 and 2 represented two repeats.

圖2 三七bHLH、ERF、MYB、WRKY1和GAPDH特征片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

Fig.2 Agarose gel electrophorogram of the characteristic fragments of thebHLH,ERF,MYB,WRKY1, and

GAPDHofP.notoginseng

2.3 三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1轉(zhuǎn)錄水平在綠紫莖中的縱向變化

從三七綠紫莖的頂端向基部，三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1的相對轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)為不同形式的曲線(圖3)。bHLH的轉(zhuǎn)錄水平呈波動(dòng)式平緩上升曲線，在莖段18處的水平最高，約為2.862(圖3A)；F莖段≈25.58>F0.01(17，18)≈3.16，故bHLH轉(zhuǎn)錄水平在各莖段間的差異達(dá)極顯著水平。ERF的水平表現(xiàn)為一條不規(guī)則7峰曲線，7個(gè)峰分別出現(xiàn)在莖段1、3、5、7、10、14和16，其相對表達(dá)量依次為1.000、1.297、1.507、1.071、1.241、1.686和1.598(圖3B)；F莖段≈5.30>F0.01(17，18)≈3.16，故ERF轉(zhuǎn)錄水平在各莖段間的差異達(dá)極顯著水平。MYB的水平表現(xiàn)為一條波動(dòng)幅度逐漸增大的6峰曲線，在莖段15處的水平最高，為3.368(圖3C)；F莖段≈16.31>F0.01(17，18)≈3.16，故MYB轉(zhuǎn)錄水平在各莖段間的差異達(dá)極顯著水平。WRKY1的水平表現(xiàn)為一條近似2個(gè)主峰的6峰曲線，2個(gè)主峰分別出現(xiàn)在莖段9和莖段12，轉(zhuǎn)錄水平分別為1.708和1.921(圖3D)；F莖段≈5.37>F0.01(17，18)≈3.16，故WRKY1轉(zhuǎn)錄水平在各莖段間的差異達(dá)極顯著水平。此外，在任何莖段中，4種TF的轉(zhuǎn)錄水平也不一致(圖4)，如：在莖段5，ERF和MYB的水平最高，bHLH的次之，WRKY1的最低?？梢姡?種TF在三七綠紫莖中的轉(zhuǎn)錄水平具有組織(不同莖段)特異性。

注：A、B、C和D分別表示bHLH、ERF、MYB和WRKY1。

Note: A, B, C and D represented thebHLH,ERF,MYB, andWRKY1, respectively.

圖3 三七紫莖中bHLH、ERF、MYB和WRKY1轉(zhuǎn)錄水平的縱向變化

Fig.3 Longitudinal variations of the transcriptional levels of thebHLH,ERF,MYBandWRKY1 ofP.notoginseng

圖4 三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1在三七綠紫莖中的相對轉(zhuǎn)錄水平熱圖

Fig.4 Heatmap of the relative transcriptional levels of thebHLH,ERF,MYBandWRKY1 in the purplish-green stems ofP.notoginseng

2.4 三七綠紫莖中總?cè)圃碥蘸康目v向變化

從圖5可知，自三七綠紫莖的頂部向基部，總?cè)圃碥蘸?TTSC)總體呈1條V形曲線，最低TTSC出現(xiàn)在莖段7，為3.837 mg/g FW；三萜皂苷主要集中在莖黃金分割點(diǎn)的下部，其含量約是上部的1.7倍，占整個(gè)莖段TTSC的63.2%；經(jīng)方差分析，F(xiàn)莖段≈248.578>F0.01(17，18)≈3.16，故TTSC在不同莖段間的差異達(dá)極顯著水平。

注：1～18表示莖從頂部向基部被均分為18段。

Note:1～18 indicated that the stems were evenly divided into 18 segments from the tops to the bases.

圖5 三七綠紫莖中總?cè)圃碥蘸康目v向變化

Fig.5 Longitudinal variations of the total triterpenoid saponins in the green-purple stems of

P.notoginseng

2.5 三七綠紫莖中bHLH、ERF、MYB和WRKY1轉(zhuǎn)錄水平與總?cè)圃碥蘸块g的相關(guān)性

從表2可知，在三七綠紫莖中，三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1轉(zhuǎn)錄水平與三萜皂苷含量(TTSC)間的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.371、0.130、-0.169和-0.195，可見，與綠紫莖三萜皂苷合成相關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)閎HLH，其次為ERF。同時(shí)，4種轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)錄水平間的Pearson相關(guān)系數(shù)不同，bHLH與ERF間、bHLH與WRKY1間、ERF與MYB間均呈不顯著正相關(guān)。所以，在三七綠紫莖中，4種轉(zhuǎn)錄因子基因沒有構(gòu)建成共轉(zhuǎn)錄群。

表2 三七綠紫莖中4種轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)錄水平間及總?cè)圃碥蘸块g的Pearson相關(guān)系數(shù)

Table 2 Pearson correlation coefficients between the transcriptional levels of thebHLH,ERF,MYBandWRKY1 ofP.notoginsengand the total triterpenoid saponin content as well as those among the four TFs in the green-purple stems ofP.notoginseng

項(xiàng)目ItembHLHERFMYBWRKY1TTSC0.3710.130-0.169-0.195bHLH10.275-0.0170.106ERF10.410-0.399MYB1-0.337WRKY11

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，從三七綠紫莖的頂部到基部，三七bHLH、ERF、MYB和WRKY1的轉(zhuǎn)錄水平分別呈1條波動(dòng)式平緩上升、不規(guī)則7峰、波動(dòng)幅度逐漸增大的6峰和2個(gè)主峰的6峰曲線；其中，bHLH主要在莖的中部和基部表達(dá)，ERF轉(zhuǎn)錄水平的7個(gè)峰分別出現(xiàn)在莖段1、3、5、7、10、14和16，MYB主要在莖的中部表達(dá)，WRKY1轉(zhuǎn)錄水平的2個(gè)主峰分別出現(xiàn)在莖段9和12，WRKY1主要在莖的中部表達(dá)；三七綠紫地上莖的總?cè)圃碥蘸?TTSC)大體呈V型曲線，最低TTSC出現(xiàn)在莖段7，即莖上部的黃金分割點(diǎn)處，黃金分割點(diǎn)下部TTSC約是上部的1.7倍。4種轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)錄水平和TTSC在不同莖段間的差異均達(dá)極顯著水平。bHLH、ERF、MYB和WRKY1轉(zhuǎn)錄水平與TTSC間的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.371、0.130、-0.169和-0.195，表明與三七綠紫莖三萜皂苷合成相關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子為三七的bHLH，其次為ERF，而MYB和WRKY1對皂苷的合成無正面貢獻(xiàn)，其分子原因暫不明。同時(shí)，4種TF對三七其他器官三萜皂苷合成的差異性調(diào)控效應(yīng)尚待研究。

對于bHLH、ERF、MYB和WRKY在不同種的高等植物的三萜皂苷生物合成中，發(fā)揮主要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子不盡相同。如調(diào)控蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)三萜皂苷合成的主要轉(zhuǎn)錄因子為bHLH[17]，但調(diào)控西洋參(Panaxquinquefolius)三萜皂苷合成的主要轉(zhuǎn)錄因子卻為WRKY[18]。另一方面，除bHLH、ERF、MYB和WRKY外，可能還有其他轉(zhuǎn)錄因子參與包括三七在內(nèi)的高等植物三萜皂苷生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如：同源異型盒(homeobox)和堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)可能也參與了調(diào)控三七三萜皂苷的生物合成[1]。可見，調(diào)控高等植物三萜皂苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子具有明顯的種特異性和多樣性特征。