鐘順平，劉應(yīng)華，楊貴偉，楊貴樹，高利波*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.云南省勐臘縣勐侖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 西雙版納 666303)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是一種無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒。2006年以前，全球范圍內(nèi)僅有豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)2個基因型[1]。PCV1感染后對豬無致病性[2]，而PCV2則可引起一系列豬圓環(huán)病毒相關(guān)病征，主要有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、繁殖障礙、豬皮炎腎病綜合征、先天性震顫、豬呼吸道疾病綜合征、腸炎、增生性和壞死性肺炎等。自20世紀(jì)末爆發(fā)以來，PCV2已成為嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的病原體之一，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。2016年6月，美國首次報道新型豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)，豬感染后皮膚出現(xiàn)多灶性丘疹、斑點和淺表性皮炎，厭食、妊娠母豬會出現(xiàn)繁殖障礙，生產(chǎn)性能下降，流產(chǎn)、產(chǎn)弱胎、死胎和木乃伊胎，產(chǎn)仔體弱，病情嚴(yán)重則造成急性死亡[4-5]。隨著養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，云南省豬病的發(fā)生越加復(fù)雜，為更好地了解和監(jiān)控云南省勐臘縣PCV2和PCV3的感染流行情況，采用PCR方法對2019年該地區(qū)送檢的樣品進(jìn)行病原檢測，以期為PCV2和PCV3的后續(xù)研究與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣品 檢測樣品86份，其中，血液樣品59份，糞便樣品27份，均采于云南省勐臘縣規(guī)模化養(yǎng)殖豬場。

1.1.2 主要試劑與儀器 試劑：DNA提取試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司)，2×Transhifi Super Mix II(含Tag TM DNA聚合酶，RNaase Inhibitor, dNTP,ddH2O，北京全式金公司)，DNA Marker DL1000、DL2000(大連寶生物公司)，瓊脂糖(GENE公司)；其他試劑由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室提供，試劑均為分析純。儀器：移液器(DRAGON公司，KA0052521)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-1FD)，高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific公司，75005440)，凝膠成像系統(tǒng)(天能科技有限公司，Tanon-1600)，電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-7C)，普通PCR儀(BIO-RAD公司，580BR 12007)，恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，HWS12)。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI GenBank中公布的PCV2(AF118095、AF118097、AF027217)和PCV3(KY075990、MF589106、KX966193)基因序列，分別設(shè)計針對PCV2和PCV3的特異性引物(表1)用于PCR檢測。設(shè)計好的引物送至昆明碩擎生物公司合成。

表1 PCV2和PCV3基因擴增引物信息

Table 1 Primer information of PCV2 and PCV3 gene amplification

引物名稱Primer name引物序列(5′-3′)Prime sequence目的片段/bp Target fragmentPCV2FATGACGTATCCAAGGAGGCGTT702PCV2RTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCT702PCV3-FTTACTTAGAGAACGGACTTGTAACG651PCV3-RAAATGAGACACAGAGCTATATTCAG651

1.3 樣品DNA提取

樣品預(yù)處理、提取DNA均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，DNA于-20℃條件下冷凍備用。

1.4 PCR擴增

用提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴增，PCR反應(yīng)體系：2×TransHiFiII 12.5 μL、ddH2O:10.5 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、DNA 1.0 μL，總的反應(yīng)體系為25 μL。PCV2 PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)；PCV3 PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)；取10 μL PCR擴增產(chǎn)物配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠(含0.2%EB)孔中，并在120 V電壓下進(jìn)行30 min的電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

1.5 PCR檢測鑒定

利用特異性引物及對應(yīng)的PCR檢測方法檢測采集的59份血液和27份糞便樣品，并通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2感染情況

從圖1看出，PCV2的電泳結(jié)果同預(yù)期目的片段大小(702 bp)相符，表明部分樣品中PCV2檢測呈陽性。在86份樣品中，31份樣品檢測為PCV2陽性，陽性率為36.05%。59份血液樣品中18份樣品檢測結(jié)果為陽性，陽性率為30.50%；27份糞便樣品中13份樣品檢測結(jié)果為陽性，陽性率為48.15%。

注：1～10為PCV2抗原，11為陰性對照，M為Marker。

Note: 1-10,PCV2 antigen; 11, negative control; M, Marker.

圖1 PCV2 PCR擴增電泳結(jié)果

Fig.1 PCR amplification electrophoresis results of PCV2

2.2 PCV3感染情況

從圖2看出，PCV3的電泳結(jié)果同預(yù)期目的片段大小(651 bp)相符，表明部分樣品中PCV3檢測呈陽性。86份樣品中，15份樣品檢測為PCV3陽性，陽性率為17.44%。59份血液樣品中11份樣品檢測結(jié)果為陽性，陽性率為18.64%；27份糞便樣品中4份樣品檢測結(jié)果為陽性，陽性率為14.81%。

注：1為PCV3抗原對照，2～9為PCV3抗原，M為Marker。

Note:1, PCV3 antigen control; 2-9, PCV3 antigen; M, Marker.

圖2 PCV3 的PCR擴增電泳結(jié)果

Fig.2 PCR amplification electrophoresis results of PCV3

2.3 PCV2和PCV3混合感染情況

在送檢的86份樣品中，有13份樣品同時檢測到PCV2和PCV3陽性，混合感染率為15.12%。59份血液樣品中有8份同時檢測到PCV2和PCV3陽性，混合感染率為13.56%；27份糞便樣品中有5份同時檢測到PCV2和PCV3陽性，混合感染率為18.52%。

3 結(jié)論與討論

對云南省勐臘縣部分豬場采集的86份血液及糞便樣品PCR檢測結(jié)果表明，31份樣品檢測為PCV2陽性，陽性率為36.05%，比彭潔等[6]2013-2015年對云南省部分豬場豬組織樣品檢測的PCV2陽性率(17.65%～21.59%)高14.46～18.40百分點，比羅曉燕等[7]2015-2017年對云南玉溪部分豬場PCV2的病原陽性率(5.67%)高30.38百分點，原因可能是勐臘縣氣溫高，更適宜病毒的傳播，這和張治濤等[8]的報道相符。曾彩虹等[9]研究發(fā)現(xiàn)，2017-2018年云南省8個地(市)12個縣(區(qū))檢測出PCV3陽性樣品，陽性率為9.98%，表明PCV3已在云南省的多個地區(qū)普遍存在。研究檢測發(fā)現(xiàn)，PCV3的陽性率為17.44%，較2017—2018年高，說明PCV3的感染愈加廣泛。在送檢的樣品中，PCV2和PCV3混合感染的有13份，混合感染率達(dá)15.12%，感染率較高。表明，PCV2和PCV3在勐臘縣呈一定的流行趨勢，應(yīng)加強對該病的防控工作。

PCV嚴(yán)重侵害豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致患病豬只體況下降，很容易導(dǎo)致豬群中同時有多種疾病綜合征發(fā)生。自我國2000年首次報道PCV2后，該病已經(jīng)在我國豬場中廣泛存在，陽性感染率都比較高，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展形成了巨大的威脅[5，10-11]。KU等[12]首先報道在中國豬群中存在PCV3感染，在所檢測的遼寧省、江西省等10個省市樣品中均可檢測到PCV3。截至目前我國已有20余個省份陸續(xù)報道豬場存在PCV3感染與流行，且疾病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，感染的范圍越來越廣泛[13-15]。勐臘縣生豬規(guī)?；B(yǎng)殖水平較低，主要以家庭式養(yǎng)殖為主，且飼養(yǎng)環(huán)境較差，容易使豬只免疫力降低，給病原的入侵提供了條件，各種傳染病很容易流行。動物防疫部門和養(yǎng)殖戶需采取相應(yīng)的防控措施，加強對豬群的飼養(yǎng)管理。