王 音

(山西師范大學(xué)臨汾學(xué)院 自然科學(xué)系，山西 臨汾 041000)

0 引言

迷迭香酸(Rosmarinic acid)常見于草本植物中，易溶于水，分子式為C18H16O8，相對(duì)分子質(zhì)量為360.3[1]，具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗腫瘤、抗菌及保護(hù)肝臟[4]等作用.目前，各種病原菌耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，細(xì)菌的快速傳播和極強(qiáng)的適應(yīng)能力導(dǎo)致人類患病甚至死亡[5-6].中草藥是人類寶貴的資源，目前從天然化合物中尋找抗菌試劑是研究的熱點(diǎn)內(nèi)容.因此，本實(shí)驗(yàn)研究了迷迭香酸對(duì)幾種常見細(xì)菌的抗菌能力.

1 試劑及主要儀器

1.1 菌種

三種金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和托拉斯假單胞桿菌均來(lái)源于山西師范大學(xué)臨汾學(xué)院本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.2 藥品

迷迭香酸購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基均購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)( 尚凈，型號(hào): FSF4)；HX-5S恒溫循環(huán)器(北京惠誠(chéng)佳儀科技有限公司)；恒溫?cái)?shù)顯搖床( 榮惠，型號(hào): sha-A/B/C)；U-2010 紫外-可見分光光度計(jì)(日立)；高壓滅菌鍋(浙江新豐，型號(hào): XFH-50CA)，CP64C 電子天平(天津市諾順特科電子儀器公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法[7]，將過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌稀釋到特定OD600值，隨后用MH培養(yǎng)基稀釋500倍.將混勻的菌液取100 μL加入96孔板中，隨后加入100 μL不同濃度的迷迭香酸.陽(yáng)性對(duì)照為100 μL菌液加入100 μL MH肉湯培養(yǎng)基，陰性對(duì)照為200 μL MH肉湯培養(yǎng)基.37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，肉眼觀察未長(zhǎng)出細(xì)菌、溶液未渾濁的最低濃度為MIC值.

2.2 最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

相同方法培養(yǎng)48 h后涂板[8]，培養(yǎng)基未長(zhǎng)出細(xì)菌或者菌落數(shù)≤10的最低藥物濃度即為MBC值.

2.3 殺菌曲線的測(cè)定

將細(xì)菌菌液過(guò)夜培養(yǎng)，稀釋到特定的OD600值，稀釋1 000倍后，分裝到相同的錐形瓶中.加入迷迭香酸，使其終濃度分別為2×MIC、MIC及1/2×MIC.同時(shí)設(shè)置對(duì)照組為不加藥的菌液，將錐形瓶放入搖床中，在0、3、6、9、12、24 h分別吸取10 μL涂板.通過(guò)固體培養(yǎng)基的菌落數(shù)計(jì)算總菌落數(shù)制成殺菌曲線[9].

3 結(jié)果與分析

3.1 迷迭香酸的最低抑菌濃度(MIC)

由表1可知，迷迭香酸對(duì)這5種菌均有抑制效果.其中，金黃色葡萄球菌25923在濃度為0.5 mg/mL時(shí)有抑菌效果，到1 mg/mL時(shí)可以全部抑制金黃色葡萄球菌.但是迷迭香酸對(duì)其他兩種金黃色葡萄球菌抑制效果較弱，到1.5 mg/mL才能完全抑制.對(duì)于單增李斯特菌，當(dāng)藥物濃度高于1.5 mg/mL時(shí)出現(xiàn)抑制效果，到2 mg/mL時(shí)可完全抑制該菌.托拉斯假單胞桿菌對(duì)藥物敏感度較高，在1 mg/mL時(shí)便可完全抑制細(xì)菌.

表1 最低抑菌濃度(MIC)的確定

注:“ - ”無(wú)菌生長(zhǎng)，“ + ”有少量菌生長(zhǎng)，“ + + ”菌數(shù)較多.

3.2 迷迭香酸的最低殺菌濃度(MBC)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得表2.可知，金黃色葡萄球菌8325-4和托拉斯假單胞桿菌的MBC濃度和MIC濃度相同，其他三種菌的MBC濃度相比于MIC濃度均提高了0.5 mg/mL.金黃色葡萄球菌25923、8325-4和單增李斯特菌的MBC值均為1.5 mg/mL，ATCC29213和托拉斯假單胞桿菌的MBC值為2 mg/mL.

表2 最低殺菌濃度(MBC)的確定

3.3 迷迭香酸對(duì)三種金黃色葡萄球菌的殺菌曲線

在相同的測(cè)量體系中，加入迷迭香酸，分別測(cè)定終濃度為0、1/2×MIC 、MIC及2×MIC在不同時(shí)間的 Log10CFU/m L值，結(jié)果見圖1.由圖1可知，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，三種金黃色葡萄球菌的對(duì)照組細(xì)菌菌落數(shù)不斷增長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)12 h時(shí),增長(zhǎng)速度減緩并趨于飽和.對(duì)于金黃色葡萄球菌25923，迷迭香酸濃度為1/2×MIC和MIC時(shí)，起初細(xì)菌菌落數(shù)不斷減少，到12 h后，菌落數(shù)反而增加.這說(shuō)明藥物并不能完全殺死細(xì)菌，在適宜條件下細(xì)菌會(huì)重新恢復(fù)生長(zhǎng).而金黃色葡萄球菌8325-4，在藥物濃度為MIC值時(shí)24 h內(nèi)可殺死所有細(xì)菌.金黃色葡萄球菌ATCC29213抑菌效果和25923類似，隨著藥物濃度增加抑菌效果也越來(lái)越強(qiáng).在2×MIC實(shí)驗(yàn)組中，三種金黃色葡萄球菌菌落數(shù)都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，分別在9 h、12h、24 h后完全被殺滅，由此可知，迷迭香酸對(duì)三種金黃色葡萄球菌的抑制作用由強(qiáng)至弱分別為25923、8325-4和ATCC29213.

圖1 25923、 8325-4和ATCC29213的殺菌曲線

3.4 迷迭香酸對(duì)托拉斯假單胞桿菌的殺菌曲線

在相同的測(cè)量體系中，加入迷迭香酸，分別測(cè)定終濃度為0、1/2×MIC 、MIC及2×MIC在不同時(shí)間的 Log10CFU/m L值，結(jié)果見圖2.由圖2可知，迷迭香酸濃度在MIC和2×MIC時(shí)都可以殺死所有的托拉斯假單胞桿菌.同時(shí)，2×MIC的殺菌效果比MIC效果好，相同時(shí)間內(nèi)菌落數(shù)較少.而1/2×MIC實(shí)驗(yàn)組可以抑制托拉斯假單胞桿菌的增長(zhǎng).

3.5 迷迭香酸對(duì)單增李斯特菌的殺菌曲線

在相同的測(cè)量體系中，加入迷迭香酸，分別測(cè)定終濃度為0、1/2×MIC 、MIC及2×MIC在不同時(shí)間的 Log10CFU/m L值，結(jié)果見圖3.由圖3可知，在12 h內(nèi)，2×MIC的實(shí)驗(yàn)組可以殺死所有的細(xì)菌.雖然MIC實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌菌落數(shù)顯著減少，而1/2×MIC實(shí)驗(yàn)組相比不加入迷迭香酸的實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)也有較大程度降低.

圖2 托拉斯假單胞桿菌的殺菌曲線圖3 單增李斯特菌的殺菌曲線

4 討論

迷迭香酸是一種常見的多酚羥基化合物，也是許多中草藥的活性成分，主要用于食品[10]、醫(yī)藥[11]及化妝品[12].由于其來(lái)源于天然化合物[13]，對(duì)人體危害小，因此用于抑菌劑中更加安全.

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸對(duì)常見的幾種有害菌均有不同程度的抑制作用，具有廣譜抗菌活性.通過(guò)MIC值比較抑菌效果為單增李斯特菌>金黃色葡萄球菌>托拉斯假單胞桿菌.同時(shí)MBC及抑菌曲線實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了上述結(jié)論.根據(jù)汪靖超[14]等人研究，迷迭香酸抑菌機(jī)制主要為其可增加細(xì)菌生物膜通透性，這會(huì)影響糖類、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量滲漏，導(dǎo)致細(xì)菌正常代謝出現(xiàn)問(wèn)題；同時(shí)迷迭香酸也影響蛋白質(zhì)的活性，如影響關(guān)鍵酶的酶活性等.本實(shí)驗(yàn)為迷迭香酸作為抑菌劑提供了理論支持，同時(shí)也為今后機(jī)制研究提供了基礎(chǔ).