唐維政 孫鴻高 陳少文 汪凡 朱中元

(海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科,海南 ?？?570311)

臨床上對細菌引起的感染性疾病的診斷“金標準”是細菌培養(yǎng),但細菌培養(yǎng)周期長,一般3～5天才有結果,而且血培養(yǎng)陽性率低,還可能因污染菌造成假陽性。因此,僅靠細菌培養(yǎng)無法實現(xiàn)對細菌引起的感染性疾病的早期診斷,受細菌感染的患者尤其是重癥患者也就不能及時得到抗生素治療。近年來,白細胞介素6(IL-6)、降鈣素原(PCT)、C-反應蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)等感染指標的血清學檢驗已越來越引起臨床的重視,成為了對感染性疾病早期診斷和鑒別診斷的新手段[1-4],有效地彌補了細菌培養(yǎng)周期長等缺陷。

目前,國內已普遍采用免疫熒光法或免疫膠體金法快速測定PCT、CRP和SAA,以滿足急診患者診療需求。而IL-6的檢測主要為化學發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法,這兩種方法對于基層醫(yī)院和偏遠地區(qū)小型醫(yī)院不適用。我們試圖開發(fā)一種IL-6、PCT、CRP和SAA膠體金聯(lián)合快速檢測系統(tǒng),為沒有先進檢測設備的醫(yī)療機構對急診患者細菌感染的早期診斷、合理使用抗菌藥物及療效評估提供血清學依據。本實驗對IL-6原核蛋白在大腸桿菌中表達及純化,為探索建立血清IL-6快速測定方法奠定前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒與菌株 pCzn1 質粒、TOP10 克隆菌株及表達菌株Arctic-ExpressTM均由南京淘普生物技術有限公司提供。

1.1.2主要試劑 限制性內切酶NdeI和XhoI購自寶生物工程(大連)有限公司,Pfu DNA聚合酶購自南京淘普生物技術有限公司(貨號PC12)。胰蛋白胨、酵母粉購自英國OXOID公司,瓊脂糖購自上?；蚬?。DNA膠純化試劑盒、質粒小提試劑盒購自美國AXYGEN公司。

1.2方法

1.2.1IL-6基因合成 根據基因庫IL-6蛋白的基因序列,由南京淘普生物技術有限公司采用基于 PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法,設計全長拼接引物,在引物的兩端各設計了保護性堿基合成基因IL-6。

1.2.2重組質粒pCzn1-IL-6構建 使用限制性內切酶NdeI和XhoI分別對合成基因PCR回收產物和pCzn1空載體進行雙酶切 ,酶切后產物經瓊脂糖凝膠電泳后回收純化進行連接反應,按10 μL反應體系:10×連接緩沖液1 μL、pCzn1質粒1μL、PCR產物4 μL、T4DNA連接酶1 μL,去離子水補充至10 μL?；靹蚝笏矔r離心,置22 ℃過夜連接。連接產物化學法轉化入TOP10 克隆菌株,使用含終濃度為50 mg/L氨芐西林的LB平板進行篩選,挑選PCR陽性克隆送南京淘普生物技術有限公司測序。

1.2.3質粒酶切鑒定 以限制性內切酶NdeI和XhoI對重組質粒進行切割,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測pCzn1線性化載體和IL-6插入基因的大小。酶切體系：質粒：3 μL,內切酶1：0.25 μL,內切酶2 ：0.25 μL,10×Buffer：1.0 μL,雙蒸水加至10μL。

1.2.4原核蛋白的誘導表達及鑒定 將pCZN1 -IL-6載體轉化至大腸桿菌Arctic Express ：將質粒1 μL加入100 μL感受態(tài)細菌中,置冰上20 min；42 ℃熱激90 s,迅速置冰中5 min；加入600 μL LB培養(yǎng)液；37 ℃,220 r/min振搖1 h,離心后全部涂布于含50 μg/mL Amp的LB平板,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。IPTG誘導pCZN1 -IL-6載體原核蛋白的表達：挑取轉化平板上的單克隆接種于3 mL LB培養(yǎng)液的試管中,37 ℃振搖過夜；次日按1∶100接種于30 mL LB培養(yǎng)液中,37 ℃ 振搖至菌體OD600為0.6～0.8；取出1 mL培養(yǎng)物離心棄上清,用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,37 ℃ 220 r/min振搖4 h,誘導融合蛋白表達；取出1 mL培養(yǎng)物,室溫離心棄上清,用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀,剩余培養(yǎng)物離心棄上清,用 PBS重懸菌體沉淀,重懸液進行超聲波破碎后,分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸；進行12% SDS-PAGE檢測分析,考馬斯亮藍染色顯帶。

1.2.5原核蛋白的Ni柱親和純化及結果分析 上述誘導表達后的菌液Ni柱純化：利用低壓層析系統(tǒng)按照其說明書進行純化,對純化樣品進行12% SDS-PAGE及Western Blot鑒定。

2 結 果

2.1pCzn1-IL-6測序驗證 重組質粒pCzn1-IL-6化學法轉化入TOP10 克隆菌株,使用LB平板進行篩選,挑選PCR陽性克隆送南京淘普生物技術有限公司測序,測序結果與預期序列一致,證實插入基因序列正確,無突變、缺失,可以確定pCZN1 -IL-6原核表達質粒構建成功。測序結果與預期序列進行比對。見圖1。

圖1 部分序列比對結果圖

2.2質粒酶切鑒定 重組質粒經雙酶切后,經瓊脂糖凝膠電泳鑒定,IL-6基因片段在500 bp稍上位置,與預期目的片段550 bp相符(圖2)。

注：Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500；基因名稱：IL-6(OD260/OD280:1.82)；酶切鑒定：NdeI - XhoI； M:Marker；Line1:酶切前質粒；Line2: 酶切后質粒圖2 質粒酶切鑒定

2.3原核蛋白的誘導表達及鑒定 pCZN1 -IL-6重組質粒轉化至大腸桿菌Arctic Express, 利用終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導蛋白表達,培養(yǎng)物經12% SDS-PAGE分析。誘導后在目的蛋白約24.15KD 區(qū)域有明顯的特異條帶,未誘導的菌株無特異的表達條帶,目標蛋白主要存在于沉淀中,說明原核蛋白的誘導表達成功。在誘導破碎后上清和沉淀中都有目的條帶,說明IL-6蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在于表達菌中,主要以包涵體形式存在。見圖3。

注：M:蛋白質分子質量標準, 1: 未誘導；2: 誘導后；3: 誘導破碎后上清；4: 誘導破碎后沉淀圖3 蛋白表達鑒定SDS-PAGE分析

2.4原核蛋白Ni柱純化及結果分析 包涵體經過變復性的方式,重溶目標蛋白,通過Ni柱親和純化獲得目標蛋白,進行12% SDS-PAGE分析,結果見圖4。

注：M:蛋白質分子質量標準；1: 破碎后處理樣品；2: 流出；3: 洗脫圖4 蛋白純化SDS-PAGE分析

2.5Western Blot結果分析 取純化樣品5 μl經聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜,再經一抗和二抗反應,最后ECL顯影,曝光。在14～25 KD之間有明顯的曝光條帶,目的蛋白為24.15 KD。Western Blot檢測結果結果見圖5。

注：M:蛋白質分子質量標準 1: 純化后樣品圖5 蛋白Western Blot鑒定分析

3 討 論

IL-6是細胞因子之一,具有多種生物活性,由多種組織細胞產生,可以調節(jié)免疫應答、急性期反應以及造血功能等,在眾多疾病中發(fā)揮著重要作用[5]。炎癥反應發(fā)生后,IL-6率先生成,檢測血清中IL-6濃度可用來輔助急性感染的早期診斷。IL-6半衰期僅1h,在感染控制后其血清濃度下降更快、幅度更大,能更快地反映抗生素治療的效果。有研究報告IL-6還是急危重癥患者感染嚴重程度及病情預后評估的良好指標[6-7]。研究表明,盡管單獨的IL-6血清學檢驗有重要臨床價值,但其他非感染因素也可致IL-6升高[8],其與PCT、CRP及SAA等感染指標聯(lián)合檢測對臨床評估患者并發(fā)細菌感染時具有更佳的評估效能,可彌補各個指標單獨測定的不足,更有助于醫(yī)生早期發(fā)現(xiàn)感染[9-10],在鑒別診斷、療效監(jiān)測、預后評估上更有價值[11-13]。目前,抗菌藥物臨床應用管理日趨嚴格和規(guī)范化,由于細菌培養(yǎng)耗時較長及用藥后也不適合做細菌培養(yǎng),故治療中判斷抗生素治療的效果主要靠感染指標的血清學檢驗,對于敗血癥和膿毒血癥等重癥患者來講,快速檢測感染性血清學指標就顯得尤為重要。目前國內PCT、CRP和SAA單個項目的快速測定應用已較為普遍,IL-6的快速測定應用還不多見。我們試圖研制一種IL-6、PCT、CRP和SAA快速聯(lián)合檢測卡,生產IL-6純化蛋白用于抗體的制備是首要的任務。

本研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得IL-6的包涵體蛋白。大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因工程中較為常用的一種,其優(yōu)點是遺傳背景比較清楚,表達水平較穩(wěn)定,操作相對容易,實驗成本低,蛋白表達量高及容易純化等。本實驗采用基于 PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法,設計全長拼接引物,通過PCR得到了IL-6合成基因,并將其插入原核表達質粒pCZN1,構建了重組表達載體pCZN1 -IL6?？寺【杲洔y序和載體的雙酶切證明構建的表達載體正確。pCZN1 -IL6重組質粒轉化至大腸桿菌Arctic Express,參照文獻[14-15],利用終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導蛋白表達,成功地在大腸桿菌Arctic Express中表達出IL-6蛋白。在誘導表達時,隨著誘導時間的延長,蛋白表達量逐漸上升,至第4 h時表達量最高。該重組蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在,主要以包涵體形式存在,通過Ni柱親和純化獲得分子量24.15KD的目標蛋白。

本研究成功合成IL-6融合蛋白,為下一步抗體制備等后續(xù)工作奠定了必要的實驗基礎。