張東閣 郭艷玲 宇杰

[摘要]目的 建立氣相色譜法（GC）測(cè)定糖精鈉中鄰、對(duì)甲苯磺酰胺。方法 DB-17MS毛細(xì)管色譜柱，初始溫度180℃保持20 min，以10℃/min升至260℃，保持32 min。結(jié)果 鄰甲苯磺酰胺在11.80～223.60 μg/ml（r=1）內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為96.58%，RSD為5.73%（n=6）。對(duì)甲苯磺酰胺在10.15～203.00 μg/ml（r=1）內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為103.99%，RSD為2.83%（n=6）。6個(gè)批次的糖精鈉中鄰、對(duì)甲苯磺酰胺含量測(cè)定由于結(jié)果低于檢測(cè)限，未檢出，符合藥典要求。結(jié)論 GC測(cè)定糖精鈉中甲苯磺酰胺含量操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可作為糖精鈉的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

[關(guān)鍵詞]氣相色譜法;糖精鈉;甲苯磺酰胺;含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R917? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）5（c）-0031-05

Content determination of o/p-toluenesulfonamide in saccharin sodium by the gas chromatography

ZHANG Dong-ge1，2? ?GUO Yan-ling2? ?YANG Yu-jie1

1. Chengde Medical University， Hebei Province， Chengde? ?067000， China; 2. Jingfukang Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Hebei Province， Chengde? ?067000， China

[Abstract] Objective To establish the gas chromatography for the determination of o/p-toluenesulfonamide in saccharin sodium. Methods DB-17MS chromatographic column was applied， the initial temperature was set at 180 ℃ for 20 min， and then heated up to 260℃ at 10℃/ min and maintained for 32 min. Results The peak area of o-toluenesulfonamide in 11.80-223.60 μg/ml （r=1） showed a good linear relationship with the concentration， the average sample recovery rate was 96.58%， and the RSD was 5.73% （n=6）. The peak area of p-toluenesulfonamide in 10.15-203.00 μg/ml （r=1） showed a good linear relationship with the concentration， the average sample recovery rate was 103.99%， and the RSD was 2.83% （n=6）. The content of o/p-toluenesulfonamide in saccharin sodium in 6 batches was not detected because the results were lower than the detection limit， which met the requirements of the pharmacopoeia. Conclusion The GC for the determination of toluenesulfonamide in saccharin sodium is simple and accurate， and can be used as a quality evaluation standard for saccharin sodium.

[Key words] Gas chromatography; Saccharin sodium; Toluenesulfonamide; Content determination

糖精鈉是一種常用的甜味劑，據(jù)報(bào)道，在美國廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[1]。糖精鈉甜度是蔗糖的300～500倍，除了在味覺引起甜的感覺外，對(duì)人體無任何營養(yǎng)價(jià)值，安全性至今存在較大爭(zhēng)議[2-3]。糖精鈉利用甲苯法生產(chǎn)過程中，一般會(huì)生成甲苯磺酰胺這種中間品，由于生產(chǎn)過程中氧化不徹底，未完全反應(yīng)的甲苯磺酰胺未完全分離，而甲苯磺酰胺屬于致癌物[1]。甲苯磺酰胺包括鄰甲苯磺酰胺和對(duì)甲苯磺酰胺，兩種成分為同分異構(gòu)體。另有文獻(xiàn)報(bào)道糖精鈉中鄰、對(duì)甲苯磺酰胺通常認(rèn)為有致癌作用，所以樣品中這兩種雜質(zhì)的測(cè)試十分重要[4]。國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)均控制糖精鈉中雜質(zhì)鄰、對(duì)甲苯磺酰胺的含量[5]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品附加劑聯(lián)合專家委員會(huì)第十八次會(huì)議決定限制糖精鈉中全部甲苯磺酰胺異構(gòu)體少于100 PPM[6]。2015版《中華人民共和國藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》）[7]對(duì)糖精鈉中鄰、對(duì)甲苯磺酰胺含量進(jìn)行了控制，采用的是氣相色譜法（gas chromatography，GC），但在實(shí)際檢驗(yàn)過程中存在色譜條件分離度不佳的情況。另有研究人員采用紫外分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定鄰、對(duì)甲苯磺酰胺含量[8]。但是經(jīng)分析紫外分光法，準(zhǔn)確度不高;高效液相色譜法分析時(shí)間較長(zhǎng)。目前國內(nèi)利用GC同時(shí)測(cè)定鄰、對(duì)甲苯磺酰胺含量報(bào)道較少。本研究在《中國藥典》[7]方法的基礎(chǔ)上對(duì)色譜條件進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，以期得到一種更可行的色譜方法。

1儀器、試劑與試藥

1.1儀器與試劑

GC儀（島津，GC-2010）;色譜柱：DB-17MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;FID檢測(cè)器;硅藻土（分析純，天津歐博凱化工有限公司）、鹽酸（分析純，天津歐博凱化工有限公司）、二氯甲烷（優(yōu)級(jí)純，天津歐博凱化工有限公司）;玻璃色譜管（250 mm×25 mm）。

1.2試藥

鄰甲苯磺酰胺對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，100038-201204）;對(duì)甲苯磺酰胺（中國食品藥品檢定研究院，100131-201603）;糖精鈉（湖北華納大藥廠股份有限公司，批號(hào)：171101、171102、171108、171114、171105、171109、171111）。

2方法與結(jié)果

2.1氣相色譜系統(tǒng)適應(yīng)性條件

GC儀;色譜柱：DB-17MS;采用程序升溫：初始溫度180℃保持20 min，以10℃/min升至260℃，保持32 min;進(jìn)樣量：1 μl;柱流速：1.5 ml/min;分流比：5∶1;進(jìn)樣口溫度：200℃;檢測(cè)器溫度：280℃。

2.2溶液制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液的制備? 分別取鄰甲苯磺酰胺與對(duì)甲苯磺酰胺對(duì)照品，精密稱定（鄰甲苯磺酰胺稱樣量：0.012 53 g;對(duì)甲苯磺酰胺稱樣量：0.012 56 g），加二氯甲烷溶解并稀釋制成每1毫升含上述的甲苯磺酰胺異構(gòu)體各50 μg的溶液作為對(duì)照品混合溶液。

2.2.2供試品溶液的制備? 供試品溶液的制備：取本品2.0 g（稱樣量1：2.002 g;稱樣量2：2.004 g），精密稱定，用5%碳酸鈉溶液8.0 ml溶解后，加色譜用硅藻土[稱取硅藻土（過九號(hào)篩）100 g，加鹽酸800 ml，時(shí)時(shí)攪拌，浸漬12 h以上，除去酸液，再用鹽酸同樣處理3次，每次1 h，然后用水洗滌至溶液顯中性，將硅藻土分散于甲醇300 ml中，濾過，在80℃烘干]10 g，混合均勻，裝入25 mm×250 mm的色譜管，照柱色譜（通則0511第二法），用二氯甲烷洗脫約30 min，收集洗脫液50 ml，蒸發(fā)至近干，加二氯甲烷，使成1.0 ml作為供試品溶液。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取鄰甲苯磺酰胺對(duì)照品與對(duì)甲苯磺酰胺對(duì)照品，精密稱定分別置10 ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，分別制成每1毫升含上述的甲苯磺酰胺異構(gòu)體各1 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。經(jīng)稱量后最終鄰甲苯磺酰胺儲(chǔ)備液1.118 mg/ml，對(duì)甲苯磺酰胺儲(chǔ)備液1.015 mg/ml。

分別精密吸取兩種儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1、2 ml置5個(gè)10 ml容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度的鄰甲苯磺酰胺與系列濃度的對(duì)甲苯磺酰胺混合對(duì)照品溶液。進(jìn)GC樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，鄰甲苯磺酰胺線性回歸方程為y=2353.7x-3043.4，鄰甲苯磺酰胺濃度在11.80～223.60 μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1）;對(duì)甲苯磺酰胺線性回歸方程為y=2213.7x-116.81，對(duì)甲苯磺酰胺濃度在10.15～203.00 μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1）（表1，圖1～2）。

2.4檢出限

參考文獻(xiàn)[9-13]了解檢出限的具體細(xì)節(jié)后，取鄰甲苯磺酰胺對(duì)照品與對(duì)甲苯磺酰胺對(duì)照品約10 mg，精密稱定分別置25 ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解并定容至刻度，制得兩種對(duì)照品儲(chǔ)備液。經(jīng)稱量定容后得：鄰甲苯磺酰胺儲(chǔ)備液濃度為427.6 μg/ml，對(duì)甲苯磺酰胺儲(chǔ)備液濃度為431.2 μg/ml。

分別精密吸取兩種同分異構(gòu)體對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.2 ml，置兩個(gè)不同5 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，即得鄰甲苯磺酰胺母液（17.104 μg/ml）、對(duì)甲苯磺酰胺母液（17.248 μg/ml）。再分別精密吸取兩種母液各0.2 ml置同一10 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，即得甲苯磺酰胺異構(gòu)體檢出限濃度。鄰甲苯磺酰胺檢出限濃度為0.342 08 μg/ml，對(duì)甲苯磺酰胺檢出限濃度為0.344 96 μg/ml。鄰甲苯磺酰胺信噪比為3.33，對(duì)甲苯磺酰胺信噪比為2.04，全部符合2015版《中國藥典》[7]要求。

2.5儀器精密度

取鄰甲苯磺酰胺與對(duì)甲苯磺酰胺對(duì)照品，精密稱定，加二氯甲烷溶解并稀釋制成每1毫升含上述的甲苯磺酰胺異構(gòu)體各50 μg的溶液作為對(duì)照品溶液，具體如下。

分別精密吸取鄰甲苯磺酰胺儲(chǔ)備液（427.6 μg/ml）、對(duì)甲苯磺酰胺儲(chǔ)備液（431.2 μg/ml）1.2 ml，置同一10 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度即得。進(jìn)GC樣，記錄峰面積。鄰甲苯磺酰胺：51.312 μg/ml，對(duì)甲苯磺酰胺：51.744 μg/ml。精密度結(jié)果具體見表2。

2.6定量限

參考文獻(xiàn)[14-17]了解定量限的細(xì)節(jié)后，取鄰甲苯磺酰胺對(duì)照品與對(duì)甲苯磺酰胺對(duì)照品約10 mg，精密稱定分別置25 ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，制得兩種儲(chǔ)備液。鄰甲苯磺酰胺儲(chǔ)備液濃度：427.6 μg/ml，對(duì)甲苯磺酰胺儲(chǔ)備液濃度：431.2 μg/ml。

分別精密吸取兩種儲(chǔ)備液各0.2 ml，置兩個(gè)不同5 ml容量瓶中，即得鄰甲苯磺酰胺母液（17.104 μg/ml）、對(duì)甲苯磺酰胺母液（17.248 μg/ml）。再分別精密吸取鄰甲苯磺酰胺0.6 ml，對(duì)甲苯磺酰胺0.9 ml置同一10 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，即得甲苯磺酰胺異構(gòu)體定量限濃度。鄰甲苯磺酰胺定量限濃度：1.026 24 μg/ml，對(duì)甲苯磺酰胺定量限濃度：1.552 32 μg/ml。鄰甲苯磺酰胺信噪比為10.86，對(duì)甲苯磺酰胺信噪比為10.67，全部符合2015版《中國藥典》[7]要求。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取本品1.0 g，精密稱定，精密加入混合對(duì)照品溶液0.5 ml（約25 μg）用5%碳酸鈉溶液8.0 ml溶解后，加色譜用硅藻土[稱取硅藻土（過九號(hào)篩）100 g，加鹽酸800 ml，時(shí)時(shí)攪拌，浸漬12 h以上，除去酸液，再用鹽酸同樣處理3次，每次1 h，然后用水洗滌至溶液顯中性，將硅藻土分散于甲醇300 ml中，濾過，在80℃烘干]10 g，混合均勻，裝入25 mm×250 mm的色譜管，照柱色譜（通則0511第二法），用二氯甲烷洗脫約30 min，收集洗脫液50 ml，蒸發(fā)至近干，加二氯甲烷，使成1.0 ml作為供試品溶液。分別于0、1、2、4、6、8、12 h進(jìn)GC樣，記錄峰面積，計(jì)算RSD，考察穩(wěn)定性，具體結(jié)果見表3。

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“2.2.1項(xiàng)”下制備混合對(duì)照品溶液，同時(shí)精密稱定2.0 g糖精鈉，按“2.2.2項(xiàng)”下制備6份供試品溶液，進(jìn)GC樣，記錄峰面積，計(jì)算含量，具體結(jié)果見表4。

2.9回收率實(shí)驗(yàn)

2.9.1對(duì)照品儲(chǔ)備液制備? 取鄰甲苯磺酰胺對(duì)照品與對(duì)甲苯磺酰胺對(duì)照品，精密稱定分別置10 ml容量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，分別制成每1毫升含上述的甲苯磺酰胺異構(gòu)體各1 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。鄰甲苯磺酰胺貯備液濃度：1.119 mg/ml，對(duì)甲苯磺酰胺貯備液濃度：1.097 mg/ml。

2.9.2混合對(duì)照品溶液的制備? 分別精密吸取甲苯磺酰胺異構(gòu)體貯備液各0.5 ml，置同一10 ml容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，即得。鄰甲苯磺酰胺濃度：55.95 μg/ml，對(duì)甲苯磺酰胺濃度：54.85 μg/ml。

2.9.3加樣回收樣品制備? 取本品1.0 g，精密稱定，精密加入混合對(duì)照品溶液0.5 ml（約25 μg）用5%碳酸鈉溶液8.0 ml溶解后，加色譜用硅藻土[稱取硅藻土（過九號(hào)篩）100 g，加鹽酸800 ml，時(shí)時(shí)攪拌，浸漬12 h以上，除去酸液，再用鹽酸同樣處理3次，每次1 h，然后用水洗滌至溶液顯中性，將硅藻土分散于甲醇300 ml中，濾過，在80℃烘干]10 g，混合均勻，裝入25 mm×250 mm的色譜管，照柱色譜（通則0511第二法），用二氯甲烷洗脫約30 min，收集洗脫液50 ml，蒸發(fā)至近干，加二氯甲烷，使成1.0 ml作為供試品溶液。結(jié)果顯示，隨行含測(cè)未檢出，加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體見表5。

2.10樣品含量測(cè)定

取6批樣品，按“2.2.2項(xiàng)”下方法制備樣品，同時(shí)按“2.2.1項(xiàng)”下方法制備混合對(duì)照品溶液，進(jìn)GC樣，即得，具體結(jié)果見表6。

《中國藥典》[7]規(guī)定糖精鈉中總的甲苯磺酰胺 <0.0025%，6批樣品未檢出符合藥典規(guī)定，同時(shí)也與生產(chǎn)廠家的報(bào)告單一致。

3討論

本研究中，樣品檢測(cè)時(shí)未檢出鄰、對(duì)甲苯磺酰胺，這與檢驗(yàn)報(bào)告單數(shù)據(jù)一致。分析原因可能為糖精鈉在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生鄰、對(duì)甲苯磺酰胺中間品，而在后期的氧化過程中，兩種中間品大部分被分離，僅剩余非常少的一部分，而剩余的少部分低于檢出限，很可能埋于噪音中，所以本研究不能絕對(duì)地?cái)喽悠分幸稽c(diǎn)也不含鄰、對(duì)甲苯磺酰胺。本次方法學(xué)考察由于預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品中未檢出甲苯磺酰胺，故在考察樣品的穩(wěn)定性時(shí)利用加混合對(duì)照方法。在方法學(xué)考察過程中，兩種同分異構(gòu)體檢出限濃度和定量限濃度確定過程中要首先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)得出濃度的基礎(chǔ)上再逐級(jí)稀釋直至符合限度要求。2015版《中國藥典》[7]要求鄰、對(duì)甲苯磺酰胺之和不得超過0.0025%，根據(jù)藥典規(guī)定本數(shù)量級(jí)RSD要求不高于6.0%[7]，故本研究實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的回收率實(shí)驗(yàn)RSD數(shù)據(jù)合理。該方法的分離度良好，鄰、對(duì)甲苯磺酰胺定量檢測(cè)的線性范圍廣，靈敏度高，并且具有良好的精密度，可以用于鄰、對(duì)甲苯磺酰胺的檢測(cè)。本次實(shí)驗(yàn)過程中所用到的中性硅藻土提取過程復(fù)雜，鹽酸使用量大，在制備過程中鹽酸需注意安全并及時(shí)回收避免污染環(huán)境。

生產(chǎn)中要求快速準(zhǔn)確測(cè)定出對(duì)甲苯磺酰胺和鄰甲苯磺酰胺含量，測(cè)定方法包括凝固點(diǎn)法與紫外光譜法[18-21]，但兩種方法要求操作條件比較苛刻，不易操作成功，而相關(guān)文獻(xiàn)[4，6]雖然采用的也是氣相色譜分析方法，但是兩種方法在方法學(xué)考察過程過于簡(jiǎn)單，且并未做評(píng)價(jià)方法準(zhǔn)確度的加樣回收實(shí)驗(yàn)，本研究建立的GC色譜條件分離度較好，方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可作為糖精鈉的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考，具有一定的推廣價(jià)值。

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（收稿日期：2019-09-16? 本文編輯：任秀蘭）

[作者簡(jiǎn)介]張東閣（1988-），男，內(nèi)蒙古赤峰人，承德醫(yī)學(xué)院2019級(jí)在讀碩士研究生，主要從事中藥新藥研究與開發(fā)

通訊作者：楊宇杰，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥新藥研究與開發(fā)