朱見(jiàn)深　胡明　齊靜　駱延波　張慶　李璐璐　張印　劉玉慶

摘要：青貯飼料發(fā)酵質(zhì)量好壞很大程度上由其微生物組成決定。為了解青貯玉米微生物的多樣性，利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)31個(gè)青貯飼料樣本進(jìn)行微生物多樣性分析。結(jié)果表明，青貯玉米微生物群落組成的共享核心菌屬41個(gè)，占總樣本微生物組成的87.7%，豐度較大的（≥1%）有10個(gè)菌屬，其中乳桿菌屬、克雷伯菌屬及魏斯氏菌屬分別占42.9%、12.1%、10.3%;真菌主要有念珠菌屬、黑粉菌屬、半乳糖霉菌屬等。比較乳熟期組與蠟熟期組青貯的微生物群落，發(fā)現(xiàn)玉米的成熟度不同，青貯發(fā)酵產(chǎn)品中某些屬微生物在數(shù)量上存在差別，但微生物群落組成無(wú)明顯差異。本研究可為青貯飼料微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：青貯玉米;高通量測(cè)序;微生物多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S816.5+30.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）04-0068-05

Abstract The quality of silage fermentation is largely determined by its microbial composition. In order to understand the microbial diversity of maize silage， 31 silage samples were analyzed by high throughput sequencing technology combined with the traditional pure culture. The results showed that there were 41 shared core bacteria genera in silage maize microbial community， accounting for 87.7% of the total sample microbial community. Ten genera among them were more abundance than or equal to 1%， including Lactobacillus（42.9%），?Klebsiella （12.1%）， Weissella （10.3%） and so on. Candida， Ustilago and Galactomyces were the main genera of fugus. Comparing the microbial communities of silage samples using milk-ripe and ripening maize plants， it was found that there was no significant difference in the composition of microbial communities， but some differences in the number of microorganisms in some genera in silage fermentation products. This study could provide references for the researches of structure and function of microbial communities in silage.

Keywords Maize silage; High-throughput sequencing; Microbial diversity

青貯飼料（silage）是把新鮮的青飼料如玉米秸稈、根莖類(lèi)植物以及牧草等，經(jīng)碎化、包裝、壓緊、密封等處理后，進(jìn)行微生物發(fā)酵處理，使青飼料中的纖維素降解并降低pH值，殺滅有害微生物，最大化地保留青飼料的營(yíng)養(yǎng)成分及延長(zhǎng)保存時(shí)間。青貯質(zhì)量的好壞直接影響到反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能[1]。

青貯過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的微生物發(fā)酵過(guò)程，有乳桿菌、芽孢桿菌、酵母菌、霉菌、腐敗細(xì)菌等多種微生物參與，故青貯飼料品質(zhì)的好壞與它所含的微生物有很大關(guān)系[2]。傳統(tǒng)的菌群研究方法，如研究菌體及菌落的形態(tài)特征、生理生化特征、代謝產(chǎn)物等指標(biāo)，一直沿用至今，但這些傳統(tǒng)方法離不開(kāi)純培養(yǎng)技術(shù)，操作繁瑣、復(fù)雜，耗費(fèi)大量的時(shí)間和勞力;同時(shí)自然界的微生物在微環(huán)境中有各自的生態(tài)位，獨(dú)立出來(lái)的細(xì)菌往往因失去菌群聯(lián)合代謝網(wǎng)絡(luò)很難在實(shí)驗(yàn)室條件下被純化出來(lái)[3]。這些因素造成純培養(yǎng)研究的結(jié)果不穩(wěn)定，導(dǎo)致不能全面、客觀地反映菌群結(jié)構(gòu)與功能的真實(shí)情況。即使通過(guò)純培養(yǎng)方法分離出優(yōu)勢(shì)菌株[4，5]，再根據(jù)優(yōu)勢(shì)菌制備的青貯菌添加劑也不一定是青貯飼料的最佳佐劑[6]。

核酸測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展降低了測(cè)序成本，使高通量測(cè)序成為可能[7，8]。高通量測(cè)序近些年被大量地用于腸道菌群、海洋微生物等環(huán)境微生物的研究[9，10]，也初步用于青貯微生物的研究[11，12]。本研究針對(duì)玉米植株成熟的不同階段，利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)青貯玉米的微生物多樣性進(jìn)行分析，得到比傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法更為全面的菌群數(shù)據(jù)，為青貯菌群的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

2019年4月于山東省德州市采集乳熟期（Ms，15份）和蠟熟期（Ds，16份）的全株青貯玉米材料，共31份，制成青貯料，不加任何添加劑，用封膜密封，進(jìn)行自然無(wú)氧發(fā)酵。取樣時(shí)，選取青貯玉米料內(nèi)部無(wú)氧環(huán)境下的新鮮樣品，放入抽凈空氣密封的無(wú)氧袋中，4℃冷藏，24 h內(nèi)分析。

1.2 細(xì)菌、真菌培養(yǎng)及鑒定

MRS培養(yǎng)基分離純化乳桿菌，PDA培養(yǎng)基分離純化真菌，使用Omega DNA kit提取分離純化菌株總DNA。分別進(jìn)行16S rDNA與18S rDNA PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物由青島擎科生物公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)鑒定。其中，16S rDNA擴(kuò)增引物為通用引物，序列為27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3′，1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTAC-3′;18S rDNA擴(kuò)增所用引物為基因特異性引物，序列為NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，NS8：5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′。

1.3 高通量測(cè)序試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA抽提和PCR擴(kuò)增 根據(jù)E.Z.N.A.soil試劑盒?（Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量;用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對(duì)V3—V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（PCR儀：ABI GeneAmp?9700型）。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s， 72℃延伸30 s，27個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL，包括：?5×FastPfu 緩沖液4 μL，?2.5 mmol/L dNTPs 2 μL， 引物（5 μmol/L）各0.8 μL，?FastPfu聚合酶0.4 μL，?DNA模板10 ng。

1.3.2 Illumina Miseq測(cè)序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，USA） 進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST （Promega，USA） 進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)?（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

文庫(kù)構(gòu)建步驟：（1）連接“Y”字形接頭;（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段;（3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集;（4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于50 bp的序列;barcode需精確匹配，引物允許2個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除模糊堿基;根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接，overlap需大于10 bp。去除無(wú)法拼接的序列。

使用UPARSE軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi);使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier （http：//rdp.cme.msu.edu/） 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯樣品高通量測(cè)序OTU聚類(lèi)

根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)后，總共獲得406個(gè)不同的OTUs，其中乳熟期組（Ms）貢獻(xiàn)381個(gè)，蠟熟期組（Ds）貢獻(xiàn)392個(gè)，無(wú)顯著差異。對(duì)兩組做OTU韋恩圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乳熟期獨(dú)有的OTUs個(gè)數(shù)為14個(gè)，蠟熟期獨(dú)有的OTUs個(gè)數(shù)為25個(gè)，兩組共享OTUs為367個(gè)。

2.2 不同成熟期玉米青貯的微生物多樣性評(píng)價(jià)

Chao是判斷群落物種豐富度（abundance）的指數(shù)，值越大表示物種種類(lèi)越多;ACE指數(shù)用于估算還有多少未被發(fā)現(xiàn)的物種，值越大，樣本的真實(shí)物種種類(lèi)越多;Simpson指數(shù)可用于綜合評(píng)價(jià)樣本中物種的豐富度與均勻度（evenness），其數(shù)值在0～1之間，當(dāng)物種種類(lèi)無(wú)限多（豐富度最高）且每個(gè)物種數(shù)目都一致（均勻度最高）時(shí)，Simpson值為1。由表1可以看出，蠟熟期組（Ds）較乳熟期組（Ms）多樣性指數(shù)Chao、ACE大，說(shuō)明蠟熟期組青貯玉米微生物多樣性更高;且Simpson指數(shù)也較乳熟期組大，說(shuō)明蠟熟期組的菌群組成豐富度和均勻度更高。

2.3 玉米青貯的微生物群落組成及豐度

青貯玉米飼料厭氧發(fā)酵后，微生物群落主要由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）及藍(lán)藻細(xì)菌類(lèi)（Cyanobacteria）的微生物組成，其含量分別為55.55%、32.92%、8.58%。有41個(gè)共享核心菌屬在所有樣本中存在，占總樣本微生物組成的87.7%。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果在屬水平上分析核心菌群，乳熟期和蠟熟期玉米青貯樣品在菌群組成和含量上并無(wú)明顯差異（圖2），其中，乳桿菌屬（Lactobacillus）是青貯發(fā)酵的主要菌屬，占42.9%，其隸屬于厚壁菌門(mén)芽孢桿菌綱乳桿菌目乳桿菌科，是導(dǎo)致樣本中厚壁菌門(mén)微生物含量多的直接原因;其次為克雷伯菌屬（Klebsiella）和魏斯氏菌屬（Weissella），分別占12.1%和10.3%;三者為優(yōu)勢(shì)菌群，占總量的65%左右（表2）。除此以外，蠟熟期樣品中藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、未分類(lèi)的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）略高于乳熟期樣品，后者中鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）則含量稍高。

使用MRS培養(yǎng)基分離優(yōu)勢(shì)乳桿菌并進(jìn)行16S rDNA鑒定，獲得的純培養(yǎng)經(jīng)鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等。

高質(zhì)量的青貯依賴(lài)于無(wú)氧條件來(lái)降低pH值、抑制不利菌生長(zhǎng)[13]。如果無(wú)氧條件不充分，則會(huì)使霉菌肆意生長(zhǎng)，不僅造成青貯料營(yíng)養(yǎng)成分流失，而且也會(huì)危及飼養(yǎng)動(dòng)物健康[14]。本試驗(yàn)通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)及18S rDNA鑒定，從青貯玉米料中分離到念珠菌屬、黑粉菌屬、半乳糖霉菌屬、鏈格孢屬及散囊菌屬等真菌。

2.4 不同成熟期玉米青貯的菌群組成差異分析

經(jīng)基于Bray_Curtis算法的OTU水平上的主坐標(biāo)分析（PCoA），乳熟期與蠟熟期樣品交錯(cuò)分布，但無(wú)顯著聚類(lèi)（圖3）。表明，乳熟期和蠟熟期的玉米營(yíng)養(yǎng)組成不同，青貯的微生物組成也存在些微差別，但差異并不顯著。

3 討論與結(jié)論

有研究表明乳桿菌屬是青貯飼料菌群的關(guān)鍵發(fā)酵菌[15]，本研究利用高通量測(cè)序及純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)玉米青貯的微生物多樣性分析結(jié)果也印證了這點(diǎn)。乳桿菌為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，菌體長(zhǎng)形和細(xì)長(zhǎng)，不產(chǎn)芽孢，通常無(wú)鞭毛，在無(wú)氧、酸性環(huán)境中生長(zhǎng)，有時(shí)輕微需氧，CO2濃度在5%時(shí)能促進(jìn)其生長(zhǎng)，很多乳桿菌可選用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化[16]。目前屬內(nèi)有185個(gè)種和亞種，代表菌種為德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）[17]。伯杰手冊(cè)介紹其多出現(xiàn)于植物表面，也存在于污水、動(dòng)物腸道、陰道及口腔等環(huán)境中。在青貯中常見(jiàn)的乳桿菌有布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、植物乳桿菌、戊糖乳桿菌及干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等[18，19]。隨著青貯發(fā)酵過(guò)程的深入，pH不斷降低，較耐酸的乳桿菌屬微生物更具優(yōu)勢(shì)，這可能是導(dǎo)致其含量最高的主要原因。

青貯質(zhì)量的好壞主要依賴(lài)于青貯窖藏時(shí)的無(wú)氧環(huán)境，乳桿菌可以在無(wú)氧條件下發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸，降低pH，具有一定的抗菌能力，在添加48 h后迅速繁殖，無(wú)氧條件下經(jīng)EMP途徑發(fā)酵產(chǎn)生乳酸和乙酸[20]。本研究還發(fā)現(xiàn)乳熟期和蠟熟期兩組發(fā)育成熟度不同的全株玉米用于青貯發(fā)酵，其微生物組成差異不明顯，可以進(jìn)一步結(jié)合青貯玉米營(yíng)養(yǎng)成分等質(zhì)量指標(biāo)的分析，確定制作青貯的最佳生長(zhǎng)階段。

參 考 文 獻(xiàn)：

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