史帥濤　王國權(quán)　李曉健　韓文豪　翟水亭

[摘要] 目的 探討載脂蛋白C3（APOC3）在動脈粥樣硬化病人血清中的表達(dá)及對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和連接黏附分子-1（JAM-1）表達(dá)影響。

方法 收集24例冠狀動脈無狹窄和56例冠狀動脈有狹窄心臟病病人外周血清，采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測APOC3基因和蛋白表達(dá)水平。體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞，用不同濃度的APOC3或TNF-α作用后，應(yīng)用qRT-PCR和Western blot檢測TNF-α和（或）JAM-1基因和蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果 APOC3在冠狀動脈有狹窄心臟病病人外周血清中的表達(dá)水平為（7.42±1.68）g/L，明顯高于冠狀動脈無狹窄病人的（9.36±3.65）g/L，差異有顯著性（t=2.790，P<0.05）。APOC3作用后的人血管內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α、JAM-1基因和蛋白表達(dá)水平明顯升高（F=28.746～178.421，P<0.001）。TNF-α作用后的人血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1基因和蛋白表達(dá)水平明顯升高（t=8.167、15.589，P<0.001）。

結(jié)論

APOC3在動脈粥樣硬化病人外周血清中高表達(dá)。APOC3能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α、JAM-1的表達(dá)，而TNF-α能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 冠狀動脈疾病;載脂蛋白CⅢ;連接黏附分子-1;腫瘤壞死因子α;內(nèi)皮細(xì)胞

[中圖分類號] R541.4;R977.6

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2020）03-301-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.104

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20200528.0827.001.html;2020-05-28 13：05

MEASUREMENT OF APOC3 IN THE SERUM OF ATHEROSCLEROTIC PATIENTS AND ITS EFFECT ON THE EXPRESSION OF TNF-α AND JAM-1

SHI Shuaitao， WANG Guoquan， LI Xiaojian， HAN Wenhao， ZHAI Shuiting

（Department of Vascular Surgery， Fuwai Central China Cardiovascular Hospital （Henan Peoples Hospital）， Zhengzhou， 450000， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of apolipoprotein C3 （APOC3） in the serum of patients with atherosclerosis and its effect on the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and junctional adhesion molecule 1 （JAM-1）.

Me-

thodsPeripheral sera were collected from 24 heart disease patients without coronary artery stenosis and 56 patients with coronary artery stenosis， and quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blot were used to determine the expression levels of APOC3 mRNA and protein. Human vascular endothelial cells were cultured in vitro and treated with different concentrations of APOC3 or TNF-α; then qRT-PCR and Western blot were performed to determine the expression levels of TNF-α and/or JAM-1 mRNA and protein.

ResultsThe heart disease patients with coronary artery stenosis had a significantly higher expression level of APOC3 in peripheral serum than those without coronary artery stenosis （（7.42±1.68） g/L vs （9.36±3.65） g/L;t=2.790，P<0.05）. Human vascular endothelial cells had significantly increased mRNA and protein expression of TNF-α and JAM-1 after being treated with APOC3 （F=28.746-178.421，P<0.001）， and had significantly increased mRNA and protein expression of JAM-1 after being treated with TNF-α （t=8.167，15.589;P<0.001）.

ConclusionAPOC3 is highly expressed in the peripheral serum of patients with atherosclerosis. APOC3 can promote the expression of TNF-α and JAM-1 in vascular endothelial cells， while TNF-α can promote the expression of JAM-1 in vascular endothelial cells.

[KEY WORDS]coronary artery disease; apolipoprotein C-Ⅲ;? junction adhesion molecule 1; tumor necrosis factor-alpha; endothelial cells

心血管系統(tǒng)疾病的致死率在全部疾病中位居首位，心血管疾病嚴(yán)重危害著人類的生命健康[1]。動脈粥樣硬化是一種常見的發(fā)生于心血管系統(tǒng)的疾病，也是心血管疾病發(fā)生的征兆[2]。高血壓、高脂血癥、糖尿病、肥胖等均能夠引發(fā)動脈粥樣硬化[3]。冠心病是動脈粥樣硬化導(dǎo)致的較為典型的心血管疾病[4]。動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。載脂蛋白C3（APOC3）廣泛存在于人體內(nèi)，在循環(huán)血漿中穩(wěn)定表達(dá)[5]。APOC3與冠心病、高血壓、糖尿病等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。血管內(nèi)皮細(xì)胞存在于血管的最內(nèi)層，在動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中具有重要的作用，而APOC3是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的障礙因子[7]。目前，關(guān)于APOC3對血管內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與連接黏附分子-1（JAM-1）表達(dá)的影響還不明確。本研究分別收集了冠狀動脈有狹窄和無狹窄心臟病病人外周血清，檢測APOC3的表達(dá)水平，并以血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，

探討APOC3對TNF-α與JAM-1表達(dá)影響，以期為進(jìn)一步研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年12月—2018年10月，選取在我院行手術(shù)或冠狀動脈造影檢測的心臟病病人80例，男性42例，女性38例，平均年齡48歲。其中有冠狀動脈狹窄者56例，無狹窄者24例。均符合文獻(xiàn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。冠狀動脈狹窄病人與無狹窄者的年齡、性別等均匹配。本研究病人及家屬均知情同意，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞購自美國ATCC公司。APOC3、TNF-α試劑購自Prepro Tech公司;TNF-α、JAM-1、GAPDH單克隆抗體購自美國CTS公司;人APOC3 ELISA檢測試劑盒購自上海超研生物科技有限公司;CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;倒置顯微鏡購自日本尼康公司。實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒、cDNA合成試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司;CFX 96Touch熒光定量PCR儀、GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清APOC3水平檢測 采集80例心臟病病人空腹12 h后的外周靜脈血3 mL。血液凝固后分離出血清。采用ELISA法檢測血清中APOC3含量。按照試劑盒說明書操作。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存于液氮罐中的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，置37 ℃培養(yǎng)箱中融化后，加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清（FBS）的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，觀察細(xì)胞約為90%融合時，棄掉細(xì)胞懸浮液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 qRT-PCR檢測人血管內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α、JAM-1 mRNA表達(dá) 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞后，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度使每孔中加入的細(xì)胞數(shù)為4×105個。置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清液。在細(xì)胞中分別加入終濃度為0、15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入Trizol細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞RNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明書分別檢測TNF-α、JAM-1 mRNA水平。所用引物及其序列見表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。

1.3.4 Western blot檢測人血管內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α、JAM-1蛋白表達(dá) 人血管內(nèi)皮細(xì)胞分別經(jīng)0、15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，放置于冰上裂解30 min。4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取蛋白上清至新EP管中，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。蛋白樣品與Loading buffer煮沸變性后，加入到SDS-PAGE凝膠孔中，每孔中加入變性蛋白樣品50 μL，以初始電壓為80 V電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠在4 ℃下轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。經(jīng)50 g/L脫脂奶粉封閉后，依次與一抗（1∶500）、二抗（1∶1 000）反應(yīng)后，轉(zhuǎn)移至暗室中滴加顯色液，曝光后以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。

1.3.5 TNF-α對人血管內(nèi)皮細(xì)胞JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)影響 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化后，接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含有終濃度為0、1.0 mg/L的TNF-α細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)16 h后收集細(xì)胞。采用qRT-PCR、Western blot檢測細(xì)胞中JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。步驟同1.3.3和1.3.4。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素設(shè)計(jì)方差分析。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 病人血清中APOC3含量檢測

結(jié)果表明，56例冠狀動脈有狹窄病人血清APOC3為（9.36±0.95）g/L，明顯高于24例無狹窄病人的（7.42±0.74）g/L，差異有顯著性（t=2.790， P<0.01）。

2.2 APOC3對血管內(nèi)皮細(xì)胞JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)影響

采用15、30、60、120 mg/L的APOC3作用后，血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平均高于0 mg/L者;血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平隨著15、30、60 mg/L 的APOC3作用濃度的增加而增加（F=69.633、178.421，t=9.137～17.473，P<0.01）。而120 mg/L的APOC3作用后，細(xì)胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平較60 mg/L者有所下降。見表2。

2.3 APOC3對血管內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)影響

采用15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞中 TNF-α mRNA和蛋白均明顯高于0 mg/L者（F=28.746、50.426，P<0.01）。TNF-α mRNA和蛋白水平?jīng)]有隨著APOC3作用濃度的升高而增加。見表2。

2.4 TNF-α對血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)影響

采用1.0 μg/L的TNF-α作用后，血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平均明顯高于0 μg/L者，差異有顯著性（t=8.167、15.589，P<0.01）。見表3。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種常見的動脈硬化血管疾病。動脈粥樣硬化形成與復(fù)合糖類和脂質(zhì)的聚集、血栓的形成、纖維組織增生的出現(xiàn)、動脈中層的鈣化等有關(guān)。當(dāng)病變逐漸累積到阻塞動脈腔時，由該動脈供應(yīng)的組織器官出現(xiàn)缺血甚至壞死[9]。動脈粥樣硬化血管彈性減弱，管壁上出現(xiàn)類似于米粒樣的脂類[10-11]。另外，動脈粥樣硬化會導(dǎo)致動脈腔變窄，進(jìn)而引發(fā)高血壓心臟病的發(fā)生。

載脂蛋白是指血漿脂蛋白中的蛋白成分，可以分為A、B、C、D、E等5類[11]。載脂蛋白是脂類物質(zhì)的運(yùn)輸載體，其中部分載脂蛋白還具有脂蛋白代謝酶激活、受體的識別等作用[12]。載脂蛋白C具有水溶性，能夠調(diào)控肝脂酶和脂蛋白脂酶的活性[13]。APOC3基因全長為3.1 kb，位于第11號染色體上[14]。臨床研究結(jié)果表明，APOC3能夠引起冠心病的發(fā)生，與高血壓、高脂血癥、肥胖等均有密切關(guān)系[15]。過表達(dá)APOC3小鼠的高三酰甘油血癥明顯加重，經(jīng)過飼喂高脂飼料后，小鼠出現(xiàn)脂肪肝變性和明顯的胰島素抵抗[16]。已有研究結(jié)果顯示，冠狀動脈狹窄病人血清總APOC3濃度明顯升高[17]。本文研究結(jié)果也顯示，APOC3在冠狀動脈狹窄病人血清中的表達(dá)明顯增高。

免疫炎癥是目前研究較多的動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。脂質(zhì)的積累和炎癥的共同長期作用導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生[18]。APOC3、TNF-α、JAM-1等均與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)[19]。有研究結(jié)果表明，JAM-1在動脈粥樣硬化斑塊組織中的表達(dá)增高[20]。TNF-α是一種具有多重作用的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能的作用，與動脈粥樣硬化的形

成密切相關(guān)[21]。本研究用不同濃度的APOC3作用血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察TNF-α、JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化。本文結(jié)果表明，TNF-α、JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)。其中JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴，而TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)水平并沒有出現(xiàn)濃度依賴。采用TNF-α作用后，血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)升高，提示APOC3可能通過誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1的表達(dá)。

綜上所述，APOC3在動脈粥樣硬化病人血清中表達(dá)上調(diào)。APOC3可能通過誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1的表達(dá)，APOC3可能是炎癥、細(xì)胞黏附的連接分子，有望成為預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的靶點(diǎn)。本研究為進(jìn)一步探討動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為治療動脈粥樣硬化提供了新思路。由于動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，對APOC3在動脈粥樣硬化中的具體作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]朱貴月，朱偉，潘凌云，等.? 銀杏葉片對動脈粥樣硬化性大鼠主動脈壁清道夫受體 A 表達(dá)的影響[J].? 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2016，36（4）：449-453.

[2]MENGHINI R， CASAGRANDE V， CARDELLINI M， et al. FoxO1 regulates asymmetric dimethylarginine via downregulation of dimethylaminohydrolase 1 in human endothelial cells and subjects with atherosclerosis[J].?? Atherosclerosis，? 2015，242（1）：230-235.

[3]ORG E， MEHRABIAN M， LUSIS A J. Unraveling the environmental and genetic interactions in atherosclerosis： central role of the gut microbiota[J].? Atherosclerosis， 2015，241（2）：387-399.

[4]AL RIFAI M， SILVERMAN M G， NASIR K， et al. The association of nonalcoholic fatty liver disease， obesity， and metabolic syndrome， with systemic inflammation and subclinical atherosclerosis： the multi-ethnic study of atherosclerosis （MESA）[J].? Atherosclerosis， 2015，239（2）：629-633.

[5]JENSEN M K， ARONER S A， FURTADO J D， et al. HDL That contains apolipoprotein C-Ⅲ is not inversely associated with risk of coronary events： the multi-ethnic study of atherosclerosis[J].? Circulation， 2015，131（Suppl 1）：A09.

[6]NORATA G D， TSIMIKAS S， PIRILLO A， et al. Apolipoprotein C-Ⅲ： from pathophysiology to pharmacology[J].? Trends in Pharmacological Sciences， 2015，36（10）：675-687.

[7]BELL 3RD T A， GRAHAM M J， BAKER B F， et al. Therapeutic inhibition of APOC-Ⅲ for the treatment of hypertrigly-

ceridemia[J].? Clinical Lipidology， 2015，10（2）：191-203.

[8]程誠，王鑫. 冠狀動脈狹窄程度與血清25（OH）D3的關(guān)系探討[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志， 2019，17（4）：575-577.

[9]DE WINTHER M P J， GLASS C K. Leducq epigenetics of atherosclerosis network[J].? Circ Res， 2019，124（12）：1697-1700.

[10]HEDIN U， MATIC L P. Recent advances in therapeutic targeting of inflammation in atherosclerosis[J].? J Vasc Surg， 2019，69（3）：944-951.

[11]CATTANEO M， WYTTENBACH R， CORTI R， et al. The growing field of imaging of atherosclerosis in peripheral arteries[J].? Angiology， 2019，70（1）：20-34.

[12]孫文靜，黃流清，周菲，等.? 載脂蛋白B聯(lián)合低密度脂蛋白膽固醇檢測預(yù)測急性腦梗死的價值[J].? 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志， 2018，22（21）：102-103，106.

[13]ROGERS M A， CHEN J， NALLAMSHETTY S， et al. Retinoids repress human cardiovascular cell calcification with evidence for distinct selective retinoid modulator effects[J].? Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2020，40（3）：656-669.

[14]BUTLER A A， GRAHAM J L， STANHOPE K L， et al. Role of angiopoietin-like protein 3 in sugar-induced dyslipidemia in rhesus macaques： suppression by fish oil or RNAi[J].? J Lipid Res， 2020，61（3）：376-386.

[15]BORODOVSKY A， QUERBES W， SUTHERLAND J， et al. Development of monthly to quarterly subcutaneous administration of RNAi therapeutics targeting the metabolic diseases genes PCSK9， ApoC3 and ANGPTL3[J].? Circulation， 2014，130（Suppl 2）： A11936.

[16]NATARAJAN P， KOHLI P， BABER U， et al. Association of APOC3 loss-of-function mutations with plasma lipids and subclinical atherosclerosis： the multi-ethnic bioimage study[J].? Journal of the American College of Cardiology， 2015，66（18）：2053-2055.

[17]DAI W， ZHANG Z， YAO C， et al. Emerging evidences for the opposite role of apolipoprotein C3 and apolipoprotein A5 in lipid metabolism and coronary artery disease[J].? Lipids Health Dis， 2019，18（1）：220.

[18]NATARAJAN P， COLLIER T S， JIN Z， et al. Association of an HDL apolipoproteomic score with coronary atherosclerosis and cardiovascular death[J].? J Am Coll Cardiol， 2019，73（17）：2135-2145.

[19]PEDERSEN B K. Anti-inflammatory effects of exercise： role in diabetes and cardiovascular disease[J].? Eur J Clin Invest， 2017，47（8）：600-611.

[20]吳艷梅，張穎，周琳，等.? 動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制免疫細(xì)胞方面的研究進(jìn)展[J].? 中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志（電子版）， 2018，6（32）：23-24.

[21]LIU L， NAGAI I， GAO Y， et al. Effects of catechins and caffeine on the development of atherosclerosis in mice[J].? Biosci Biotechnol Biochem， 2017，81（10）：1948-1955.

（本文編輯 于國藝）

[收稿日期]2019-08-20; [修訂日期]2020-05-09

[基金項(xiàng)目]河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2018020440）

[第一作者]史帥濤（1975-），男，碩士，主治醫(yī)師。

[通信作者]翟水亭（1964-），男，主任醫(yī)師。E-mail：zhaishui-ting2007@163.com。