劉文博　封全靈

[摘要] 目的 探討微小RNA-141-3p（miR-141-3p）對(duì)人異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞（HEEC）增殖和凋亡的影響及其機(jī)制。

方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)異位子宮內(nèi)膜組織及正常子宮內(nèi)膜組織中miR-141-3p的表達(dá)。體外原代培養(yǎng)HEEC，miR-141-3p mimics轉(zhuǎn)染至HEEC后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-141-3p與高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的靶向調(diào)控作用。

結(jié)果 異位子宮內(nèi)膜組織中miR-141-3p的表達(dá)水平明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織（t=56.880，P<0.001）;miR-141-3p過表達(dá)能顯著降低HEEC增殖活力（t=10.972，P<0.001），升高細(xì)胞凋亡率（t=18.233，P<0.001）;miR-141-3p可靶向結(jié)合HMGB1。

結(jié)論 miR-141-3p過表達(dá)可通過靶向調(diào)控HMGB1而抑制HEEC增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜異位癥;微RNAs;靶基因修復(fù);高遷移率族蛋白質(zhì)類;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R711.71;R394.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）03-0342-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.108

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200610.1435.007.html;2020-06-11 11：19

EFFECT OF MIR-141-3P EXPRESSION ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF HUMAN ECTOPIC ENDOMETRIAL CELLS AND RELATED MECHANISM

LIU Wenbo， FENG Quanling

（Department of Obstetrics and Gynecology， The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of miR-141-3p on the proliferation and apoptosis of human ectopic endometrial cells （HEECs） and related mechanism.

MethodsQuantitative real-time PCR was used to measure the expression of miR-141-3p in ectopic endometrial tissue and normal endometrial tissue. Primary HEECs were cultured in vitro， and after miR-141-3p mimics were transfected into HEECs， MTT assay was used to measure cell viability and flow cytometry was used to mea-

sure apoptosis rate. The dual-luciferase reporter experiment was used to verify the targeted regulatory effect of miR-141-3p and high-mobility group box 1 （HMGB1）.

ResultsThe expression level of miR-141-3p in ectopic endometrial tissue was significantly lower than that in normal endometrial tissue （t=56.880，P<0.001）. Overexpression of miR-141-3p can significantly reduce the proliferative activity of HEECs （t=10.972，P<0.001） and increase cell apoptosis rate （t=18.233，P<0.001）. miR-141-3p could target HMGB1.

ConclusionmiR-141-3p overexpression may inhibit the proliferation of HEECs and induce apoptosis through targeted regulation of HMGB1.

[KEY WORDS]endometriosis; microRNAs; targeted gene repair; high mobility group proteins; cell proliferation; apoptosis

目前關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1-2]。既往研究已表明，體腔化生、血管轉(zhuǎn)移等均可能引發(fā)子宮內(nèi)膜異位癥，而人異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞（HEEC）惡性增殖及凋亡能力降低是子宮內(nèi)膜異位癥的主要病理機(jī)制[3-4]。因此，深入探究HEEC增殖及凋亡的分子機(jī)制有助于提高子宮內(nèi)膜異位癥治療效果。研究已表明，微小RNA-141（microRNA-141，miR-141）在子宮內(nèi)膜異位癥病人中表達(dá)下調(diào)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未明確[5-6]。miR-141是微小RNA-141-3p（microRNA-141-3p，miR-141-3p）的前體，關(guān)于miR-141-3p對(duì)HEEC生物行為的影響及其機(jī)制研究相對(duì)較少。已有研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥病人中高遷移率族蛋白 B1（HMGB1）的表達(dá)水平升高，其可能通過調(diào)節(jié)新生血管生成而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程[7]。Target Scan網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，HMGB1可能是miR-141-3p的靶基因，但miR-141-3p是否可通過靶向調(diào)控HMGB1而影響HEEC的增殖及凋亡尚未明確。為此，本研究探討miR-141-3p表達(dá)對(duì)HEEC增殖及凋亡的影響，分析其與HMGB1的靶向調(diào)控關(guān)系及其可能作用機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年2月—2018年10月，選取本院收治的45例子宮內(nèi)膜異位癥病人為研究對(duì)象，年齡35～60歲，平均（45.52±5.62）歲。臨床分期[8]：Ⅱ期10例，Ⅲ期20例，Ⅳ期15例。所有病人均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜異位癥，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未服用性激素類藥物，于術(shù)中切取異位內(nèi)膜組織。同時(shí)，選取同期因婦科良性病變進(jìn)行子宮切除術(shù)的43例病人為對(duì)照組，年齡為42～60歲，平均（56.72±7.13）歲。所有病人均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)，術(shù)中切取正常子宮內(nèi)膜組織。排除合并其他生殖系統(tǒng)腫瘤者。兩組病人年齡、月經(jīng)周期等相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人均知情并簽署同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司;Ⅰ型膠原酶購自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司;miR-141-3p mimics、miR-141-3p抑制劑（anti-miR-141-3p）及其各自陰性對(duì)照試劑均購自廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司;MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自上海生物工程股份有限公司;Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司;雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;RIPA裂解液購自美國Sigma公司;兔抗人Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax抗體購自美國Abcam公司;HRP標(biāo)記的IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司;兔抗人HMGB1抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體外原代培養(yǎng)HEEC 應(yīng)用差速梯度離心與細(xì)胞貼壁時(shí)間差等方法分離異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。剪碎膜組織，Ⅰ型膠原酶（2 g/L）消化60 min，用100目濾網(wǎng)過濾，將含有PBS的DMEM培養(yǎng)液加入濾液內(nèi)，4 ℃條件下，以700 r/min離心7 min，棄上清，接種至培養(yǎng)皿（間質(zhì)細(xì)胞），加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)液，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)[9]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 待HEEC傳代至第3代時(shí)，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEEC，隨機(jī)分為miR-NC組（細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-141-3p組（轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimics的細(xì)胞）。嚴(yán)格按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書的步驟進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染6 h后更換含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞完成功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-141-3p表達(dá)水平 采用Trizol法分別提取正常子宮內(nèi)膜組織、異位子宮內(nèi)膜組織、HEEC的總RNA，依次分別加入200 μL 氯仿與500 μL異丙醇，4 ℃下、12 000 r/min離心15 min，棄上清，RNA沉于管底。以體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后加入適量無RNA酶水，充分溶解RNA，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR法檢測(cè)miR-141-3p相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共循環(huán)40次。miR-141-3p以U6為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-141-3p的表達(dá)水平。

1.3.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后各組的HEEC，胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸浮液，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)每孔入MTT溶液20 μL，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液150 μL，低速振蕩10 min。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEEC，PBS洗滌，胰蛋白酶消化，4 ℃下、10 000 r/min離心5 min。PBS洗滌細(xì)胞，分別加入200 μL結(jié)合緩沖液，依次加入5 μL 的Annexin V-FITC與5 μL 的PI，室溫避孵育20 min。置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.6 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-141-3p的靶基因，預(yù)測(cè)顯示miR-141-3p與HMGB1的3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，將含有miR-141-3p結(jié)合位點(diǎn)及其突變位點(diǎn)的HMGB1-3′UTR片段插入PGL3熒光素酶報(bào)告基因載體，構(gòu)建野生型（WT-HMGB1）與突變型（MUT-HMGB1）的熒光素酶報(bào)告載體。實(shí)驗(yàn)分為4組：WT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-HMGB1+miR-141-3p mimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)

染組、MUT-HMGB1+miR-141-3p mimics共轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組相對(duì)熒光素酶活性。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)HMGB1、Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax蛋白表達(dá) 分別取各組HEEC，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃條件下、12 000 r/min離心15 min。收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，取30 μg蛋白上樣進(jìn)行100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（稀釋比1∶1 000），4 ℃孵育24 h，TBST清洗;加入二抗（稀釋比1∶2 000），室溫孵育30 min，TBST洗膜。應(yīng)用ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，置于凝膠成像系統(tǒng)并應(yīng)用Quantity One軟件定量分析蛋白條帶灰度值。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常和異位子宮內(nèi)膜組織miR-141-3p表達(dá)

本文qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，正常與異位子宮內(nèi)膜組織中miR-141-3p表達(dá)水平分別為0.87±0.08和0.17±0.02，異位子宮內(nèi)膜組織中miR-141-3p表達(dá)水平較正常子宮內(nèi)膜顯著降低，差異有顯著意義（t=56.880，P<0.001）。

2.2 miR-141-3p過表達(dá)對(duì)HEEC增殖與凋亡及相關(guān)蛋白影響

HEEC中轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimics后，與miR-NC組（對(duì)照組）相比，miR-141-3p組（實(shí)驗(yàn)組）細(xì)胞活力顯著降低（t=10.972～13.403，P<0.001），細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=18.233，P<0.001），Cyclin D與Bcl-2蛋白的水平降低（t=24.931、25.456，P<0.001），P21與Bax蛋白的水平則升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.312、20.175，P<0.001）。見圖1與表1、2。

2.3 miR-141-3p靶向?qū)MGB1蛋白表達(dá)的影響

Target Scan預(yù)測(cè)顯示，HMGB1的3′UTR含有miR-141-3p的互補(bǔ)序列。見圖2A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-HMGB1+miR-141-3p mimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-HMGB1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組和MUTHMGB1+miR-141-3p mimics共轉(zhuǎn)染組HMGB1的相對(duì)熒光素酶活性分別為1.05±0.10、0.27±0.03、1.07±0.10和1.02±0.09，HEEC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimics可顯著降低含有miR-141-3p結(jié)合位點(diǎn)熒光報(bào)告載體的相對(duì)熒光素酶活性（n=9，t=22.413，P<0.001）;后兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.115，P>0.05）。Western blot的檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-NC組、miR-141-3p組、anti-miR-NC組和anti-miR-141-3p組HMGB1蛋白表達(dá)分別為0.63±0.06、0.21±0.02、0.64±0.06和0.99±0.10，各組比較差異有顯著性（n=9，F(xiàn)=208.278，P<0.001）。miR-141-3p過表達(dá)后，細(xì)胞中HMGB1蛋白的水平為0.21±0.02，與miR-NC組的0.63±0.06相比較顯著降低（t=19.922，P<0.05）;抑制miR-141-3p表達(dá)后，細(xì)胞中HMGB1蛋白水平為0.99±0.10，與anti-miR-NC組的0.64±0.06相比較顯著升高（t=9.004，P<0.05）。見圖2B。表明HMGB1是miR-141-3p的靶基因，miR-141-3p可負(fù)性調(diào)控HMGB1的表達(dá)。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥主要指子宮腔被覆內(nèi)膜外存在子宮內(nèi)膜組織生長(zhǎng)及浸潤(rùn)。研究表明，miRNA可通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程[10-12]。但仍有部分miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥中的機(jī)制尚未完全闡明，因此本研究探尋新型miR-141-3p在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程中的可能作用機(jī)制。miR-141-3p在腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-141-3p過表達(dá)后可顯著抑制細(xì)胞增殖及其侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-20]。但是，miR-141-3p在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，miR-141-3p在異位子宮內(nèi)膜組織中呈低表達(dá)，說明miR-141-3p表達(dá)降低可能參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程。本文進(jìn)一步研究顯示，miR-141-3p過表達(dá)后，HEEC的增殖能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，P21、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)。已有報(bào)道指出，Cyclin D1可正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖;P21可以通過抑制Cyclin D1與CDK4結(jié)合而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖[21-26]。Bcl-2、Bax蛋白是HEEC凋亡過程中的重要作用因子，Bcl-2蛋白表達(dá)升高可抑制HEEC凋亡，而Bax蛋白表達(dá)升高可促進(jìn)HEEC凋亡[27]。說明miR-141-3p過表達(dá)可通過干擾細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白而調(diào)節(jié)HEEC的增殖及凋亡行為。即miR-141-3p過表達(dá)可抑制HEEC的增殖，促進(jìn)其凋亡。

HMGB1在子宮內(nèi)膜異位癥病人血清中的表達(dá)水平升高，并可作為子宮內(nèi)膜異位癥診斷的重要指標(biāo)[28]。HMGB1屬于DNA結(jié)合蛋白。研究表明，HMGB1可促進(jìn)炎癥反應(yīng)及血管生成，還可通過調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程[29。相關(guān)研究報(bào)道指出，HMGB1還可通過促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌及增強(qiáng)其介導(dǎo)的免疫抑制作用而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程[30]。本研究結(jié)果表明，miR-141-3p可靶向調(diào)控HMGB1表達(dá)。提示miR-141-3p過表達(dá)可能通過靶向調(diào)控HMGB1而抑制HEEC增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥病人中miR-141-3p的表達(dá)明顯降低，miR-141-3p過表達(dá)可能通過調(diào)控HMGB1的表達(dá)而抑制HEEC的增殖及促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果為揭示子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為子宮內(nèi)膜異位癥治療提供了新的思路。但關(guān)于miR-141-3p在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生及發(fā)展過程中，具體通過調(diào)控哪種信號(hào)通路而發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步探究。

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（本文編輯 于國藝）

[收稿日期]2019-10-27; [修訂日期]2020-05-13

[基金項(xiàng)目]河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（20180214253）

[第一作者]劉文博（1983-），女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：liuwenbo201907@163.com。