屈一鳴，邵高海，張銘華，李 波，朱鳳臣，何 超，曹春風(fēng)，趙 波

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院骨科，重慶402160）

膝骨關(guān)節(jié)炎屬于常見骨關(guān)節(jié)疾病，伴隨炎癥、疼痛、骨組織病變、關(guān)節(jié)功能喪失，隨著老齡化的升高發(fā)病率逐漸升高，使膝關(guān)節(jié)功能降低，影響患者生活質(zhì)量[1]。目前臨床治療骨關(guān)節(jié)炎的方法較多，但關(guān)節(jié)自身再生能力較差，目前尚無理想治療方法，因此促進損傷軟骨的修復(fù)及進行干預(yù)、預(yù)防對于提高患者預(yù)后十分重要。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是自體血液中分離的血液制品，其含有的高濃度血小板可釋放出大量的生長因子，促進軟骨的修復(fù)，多項研究證實其能夠促進軟骨組織再生及修復(fù)[2-3]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）在固有免疫中發(fā)揮重要作用，近期研究顯示NLRP3信號通路的異常激活與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)[4]，然而其是否參與PRP修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎受損軟骨過程目前尚不清楚。本研究復(fù)制兔骨關(guān)節(jié)炎模型并給予PRP治療，旨在探究其對受損軟骨的修復(fù)作用及可能的作用機制。

材料和方法

1 實驗動物

SPF級雄性新西蘭大白兔27只，體重1.8～2.0 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)及使用許可證號為SCXK（渝）2018-0003，動物質(zhì)量合格證號為2019012704，飼養(yǎng)溫度控制在22～25℃，濕度為50%，飼養(yǎng)1周后用于實驗。

2 主要藥品、試劑與儀器

玻璃酸鈉（sodium hyaluronate，SH）注射液購于山東博士倫福瑞達制藥有限公司；蘇木素-伊紅染色試劑盒購于中杉金橋生物公司；免疫組化檢測試劑盒購于北京索萊寶有限公司；RIPA裂解液、BCA檢測試劑盒和TUNEL染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；脫鈣液購于BOSTER；兔抗鼠NLRP3、caspase-1、含caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體購于Abcam；兔抗鼠caspase-3、Bax、β-actin和Bcl-2抗體及HRP標記的Ⅱ抗購于Sigma。NLRP3抑制劑MCC950和IL-1β抑制劑eucalyptol購自MCE；NLRP3和IL-1β ELISA試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司。

RM2135型石蠟切片機購于TKO；BX53型光學(xué)顯微鏡購于Olympus；Gel Doc XR型凝膠成像儀購于Bio-Rad；OmniPAGE Maxi型垂直電泳儀購于Cleave。

3 實驗方法

3.1 PRP的制備 根據(jù)Freymiller等[5]的方法制備PRP：采集兔耳靜脈血10 mL，200×g離心10 min后，收集白層膜以上血漿，置于離心機中，800×g離心10 min，下層0.8 mL為PRP，吹打均勻，細胞數(shù)為（1.98±0.33）×109/L。

3.2 模型制備和分組 隨機選擇6只兔作為假手術(shù)（sham）組，剩余21只兔用于模型制備。采取改良Hulth法[6]制備左膝骨關(guān)節(jié)炎模型：于關(guān)節(jié)正中部位做一切口，長為4 cm，將關(guān)節(jié)腔逐層打開后，探查關(guān)節(jié)腔內(nèi)是否存在病變，將前交叉部位韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶切斷，并切除內(nèi)側(cè)半月板，止血后用生理鹽水沖洗腔內(nèi)，逐層縫合切口。造模后第1天經(jīng)肌肉注射青霉素預(yù)防感染，注射量為3×105U/kg，連續(xù)注射1周，隔天換藥至傷口愈合，觀察到兔出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、活動度降低、皮溫升高的特征，則代表模型成功，6周后停止造模。假手術(shù)組僅切開膝關(guān)節(jié)皮膚，不做其他處理。造模成功18只，將造模成功的兔隨機分為模型（model）組、SH組和PRP組，每組6只。SH組于左膝關(guān)節(jié)腔注射0.5 mL SH注射液，每周1次；PRP組于左膝關(guān)節(jié)腔注射0.5 mL PRP，每次1次；sham組和model組均注射等量生理鹽水，連續(xù)5周。

3.3 樣本采集及軟骨細胞的分離和培養(yǎng) 末次給藥結(jié)束后，兔禁食、禁水12 h，采用空氣栓塞法處死兔，立刻用手術(shù)刀截取模型組兔約1 mm×1 mm×1 mm脛骨近端軟骨面，置于DMEM培養(yǎng)液中，除去血污，青、鏈霉素雙抗清洗3次，加入胰酶消化，消化完全后，離心，棄去上清液，隨后加入0.025%Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫震蕩5 h，離心收集細胞，并用DMEM混懸，培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中。獲取膝關(guān)節(jié)腔觀察關(guān)節(jié)大體情況；將一部分軟骨組織置于10%多聚甲醛中固定24 h，另一部分軟骨組織凍存于-80℃。

3.4 軟骨大體形態(tài)觀察 肉眼觀察膝關(guān)節(jié)軟骨表面，采取Pelletier評分[7]對軟骨大體形態(tài)進行評定，根據(jù)軟骨表面缺損情況、光澤等來評定，評分為0～4分，評分越高表明軟骨損傷越嚴重。

3.5 HE染色評定軟骨病理形態(tài)學(xué)的變化 取出固定的軟骨組織，置于脫鈣液中處理10 d后，進行石蠟包埋，制備石蠟切片，切片厚度為6 μm，HE染色，參照Mankin評分[8]對軟骨組織病理學(xué)變化進行評定。

3.6 TUNEL染色觀察軟骨組織細胞凋亡情況 軟骨組織石蠟切片在二甲苯中脫蠟、乙醇中脫水后，添加不含DNase的蛋白酶，PBS洗滌3次后，在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，采取抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

3.7 免疫組化檢測NLRP3/IL-1β通路蛋白的表達采用SP染色法染色軟骨組織切片，切片經(jīng)脫蠟脫水后置于0.3%過氧化氫中孵育10 min，微波修復(fù)后采用血清封閉抗原，采用Ⅰ抗（1∶200）孵育切片，4℃冷藏過夜后，清洗后添加Ⅱ抗室溫下孵育1 h，添加鏈卵白素Ⅱ抗稀釋液，經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、透明、脫水、封片后，在光鏡下觀察蛋白染色情況，NLRP3蛋白定位在細胞膜上，ASC、caspase-1和IL-1β定位在細胞質(zhì)或細胞漿內(nèi)，用ImageJ軟件定量評估蛋白陽性表達率。

3.8 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達 軟骨組織脫鈣處理后，用RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，統(tǒng)一量取40 μg進行SDSPAGE，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉膜后，采用抗caspase-3、Bax、Bcl-2抗體（1∶300）孵育，濃膜用HRP標記的Ⅱ抗孵育，經(jīng)ECL發(fā)光顯影后用ImageJ軟件定量分析蛋白相對表達。

3.9 NLRP3和IL-1β調(diào)控關(guān)系的驗證 取分離的軟骨細胞，用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1×108/L，隨后接種到24孔板中，培養(yǎng)過夜。設(shè)置對照（control）組（不經(jīng)任何處理）、MCC950（125 μmol/L）組和eucalyptol（500 μmol/L）組，每組設(shè)置6個復(fù)孔。按照分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用ELISA測定各組細胞NLRP3和IL-1β的水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）描述，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 自體PRP對兔軟骨大體形態(tài)的影響

如圖1所示，假手術(shù)組的膝關(guān)節(jié)大體色澤明亮，關(guān)節(jié)表面平整，軟骨厚度正常，未發(fā)生退變；模型組的兔軟骨表面不平整，關(guān)節(jié)失去正常光澤，軟骨組織呈片狀剝落，見圖中虛線部位；經(jīng)SH或PRP治療后軟骨組織得到一定的修復(fù)，其中PRP組的改善優(yōu)于SH組。

Figure 1.General condition of the rabbit cartilage in each group.圖1 各組兔軟骨大體情況

與假手術(shù)組相比，模型組的Pelletier評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SH組和PRP組的Pelletier評分顯著降低（P＜0.05），且PRP組的Pelletier評分低于SH組（P＜0.05），見表1。

2 自體PRP對兔軟骨組織形態(tài)的影響

假手術(shù)組的軟骨細胞排列整齊、潮線完整清晰，基質(zhì)染色均勻；模型組的軟骨組織不清晰，軟骨層變薄，細胞紊亂排列，數(shù)量減少，潮線模糊；經(jīng)SH或PRP治療后軟骨細胞數(shù)量增多，軟骨組織、細胞形態(tài)接近正常，見圖2。

與假手術(shù)組相比，模型組的Mankin評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SH 組和 PRP組的Mankin評分顯著降低（P＜0.05），且PRP組的Mankin評分低于SH組（P＜0.05），見表1。

3 自體PRP對骨關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨細胞凋亡的影響

與假手術(shù)組相比，模型組的細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SH組和PRP組的細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），且PRP組的細胞凋亡率低于SH組（P＜0.05），見圖3、表1。

4 自體PRP對兔軟骨組織NLRP3/IL-1β通路相關(guān)蛋白表達的影響

Figure 2.HE staining was used to observe the pathomorphological changes of cartilage in rabbits（×200）.圖2 HE染色觀察兔軟骨組織病理形態(tài)學(xué)變化

與假手術(shù)組相比，模型組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白陽性表達率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SH和PRP組的NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白陽性表達率顯著降低（P＜0.05），且PRP組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白陽性表達率低于SH組（P＜0.05），見圖4、表2。

Figure 3.The apoptosis of rabbit chondrocytes observed by TUNEL staining（×200）.圖3 TUNEL染色觀察兔軟骨細胞凋亡情況

表1 各組兔軟骨Pelletier評分、Mankin評分和軟骨細胞凋亡率的比較Table 1.Comparison of Pelletier scores，Mankin scores and chondrocyte apoptotic rates in the rabbits with different treatments（Mean±SD.n=6）

5 自體PRP對兔軟骨組織凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

以陰性對照組為參考，定量描述各組蛋白表達水平，與假手術(shù)組相比，模型組的caspase-3和Bax蛋白表達顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，SH和PRP組的caspase-3和Bax蛋白表達顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表達顯著升高（P＜0.05），且PRP組的 caspase-3和Bax蛋白表達低于SH組（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達高于SH組（P＜0.05），見圖5、表3。

6 NLRP3調(diào)控IL-1β的水平

Figure 4.The protein expression of NLRP3，ASC，caspase-1 and IL-1β in the cartilage tissues detected by immunohistochemical staining（×200）.圖4 免疫組化法檢測軟骨組織中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表達

表2 各組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白的表達Table 2.The protein expression of NLRP3，ASC，caspase-1 and IL-1β in each group（Mean±SD.n=6）

Figure 5.The protein expression of caspase-3，Bax and Bcl-2 in cartilage tissues detected by Western blot.圖5 Western blot法檢測軟骨組織中caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達

細胞實驗中，與對照組相比，MCC950組NLRP3和 IL-1β的水平顯著降低（P＜0.05），eucalyptol組NLRP3的水平無明顯變化（P＞0.05），IL-1β的水平則顯著降低（P＜0.05），見表4。

討 論

骨關(guān)節(jié)炎屬于慢性退行關(guān)節(jié)疾病，病理特征主要為關(guān)節(jié)軟骨變性、軟骨下骨硬化等，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、活動受限等，病情嚴重者造成殘疾[9-10]。本研究采取改良Hulth法切除兔膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)半月板等造成關(guān)節(jié)力學(xué)失穩(wěn)，引發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎，這一過程與臨床骨關(guān)節(jié)炎機理相似，結(jié)果顯示模型組兔軟骨表面不平整，關(guān)節(jié)失去正常光澤，軟骨組織呈片狀剝落，Pelletier評分顯著高于假手術(shù)組，病理檢測發(fā)現(xiàn)軟骨層變薄，細胞紊亂排列，數(shù)量減少，潮線模糊，Mankin評分顯著高于假手術(shù)組，表明兔軟骨組織受到損傷，與以往膝關(guān)節(jié)動物模型制備結(jié)果相似[11]，提示兔骨關(guān)節(jié)炎模型制備成功。

PRP是從自身血液中分離的含高濃度血小板的血液制品，其能夠促進損傷軟骨修復(fù)，在臨床上的應(yīng)用逐漸開展起來。研究發(fā)現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎患者經(jīng)PRP治療能夠明顯改善膝關(guān)節(jié)功能，減輕患者疼痛，其治療有效率明顯優(yōu)于SH[12]。動物研究顯示骨關(guān)節(jié)炎兔經(jīng)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP能夠明顯提高軟骨細胞數(shù)量，促進軟骨修復(fù)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎兔經(jīng)SH和PRP治療后軟骨組織得到一定的修復(fù)，且Pelletier評分和Mankin評分明顯降低，PRP組Pelletier評分和Mankin評分顯著低于SH組，提示PRP能夠緩解骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷，促進軟骨修復(fù)，效果優(yōu)于SH，然而其具體機制尚不清楚。

表3 各組caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的水平Table 3.The protein levels of caspase-3，Bax and Bcl-2 in each group determined by Western blot（Mean±SD.n=6）

表4 各組NLRP3和IL-1β水平的變化Table 4.The protein levels of NLRP3 and IL-1β in each group（μg/L.Mean±SD.n=6）

NLPR3屬于NLRs家族重要成員，當受到危險信號刺激后能夠激活NLRP3蛋白，進而招募ASC和caspase-1組裝為NLRP3炎性小體，活化IL-1β前體，使其成為成熟IL-1β，分泌至胞外，發(fā)揮炎癥效應(yīng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MCC950組NLRP3和IL-1β表達降低，eucalyptol組NLRP3表達無明顯變化，IL-1β表達顯著降低，提示NLPR3調(diào)控IL-1β表達，參與炎癥反應(yīng)。過往研究顯示NLPR3炎性小體的活化與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)[15]。Fioravanti等[16]研究發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎患者血清檢測中發(fā)現(xiàn)NLPR3和IL-1β水平明顯升高，且與關(guān)節(jié)腫脹度呈正相關(guān)。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞中NLPR3、IL-1β蛋白表達明顯升高，推測NLPR3炎癥小體可能是骨關(guān)節(jié)炎新的治療靶點。Sun等[18]研究證明姜黃素通過抑制炎癥通路NLRP3激活降低炎癥細胞因子表達從而發(fā)揮對骨關(guān)節(jié)炎的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白陽性表達率顯著升高；給予SH或PRP治療后，通路蛋白陽性表達率均降低，且PRP組蛋白陽性表達率低于SH組，推測NLRP3信號通路參與兔骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，且富血小板可能通過抑制NLRP3信號通路的活化，進而發(fā)揮對關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨的保護作用。

細胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷中起著支配性作用。細胞凋亡處于正常生理進程，然而過度凋亡屬于病理性。軟骨細胞凋亡過程受到凋亡相關(guān)蛋白的控制，例如：Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，能夠抵抗多種因素引發(fā)的細胞凋亡；Bax為凋亡誘導(dǎo)因子，與Bcl-2呈拮抗作用，參與細胞凋亡[19]；caspase-3為細胞凋亡的執(zhí)行者，在接收到細胞凋亡信號刺激后，使其發(fā)生裂解活化，進而使細胞程序性凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組軟骨組織細胞凋亡率明顯升高，而給予PRP干預(yù)后細胞凋亡率明顯降低；進一步對凋亡相關(guān)蛋白檢測發(fā)現(xiàn)模型組caspase-3、Bax蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低，PRP干預(yù)后，細胞caspase-3、Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達升高，提示PRP可通過抑制軟骨組織細胞凋亡進而緩解軟骨組織損傷，發(fā)揮對節(jié)炎模型兔骨關(guān)節(jié)軟骨的保護作用。

綜上所述，PRP能夠促進骨關(guān)節(jié)炎兔受損軟骨的修復(fù)，其機制可能與抑制NLPR3/IL-1β信號通路并減少軟骨細胞凋亡有關(guān)。然而PRP僅能緩解軟骨組織損傷而不能完全逆轉(zhuǎn)，這可能與作用劑量有關(guān)，后續(xù)仍需完善設(shè)計方案，進一步充分論證PRP對骨關(guān)節(jié)炎的修復(fù)作用。