閻新佳，江園園，溫 靜，李 暢，梁 偉，鄭 威，聶承冬，李文蘭

1哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院；2黑龍江省預(yù)防與治療老年病藥物研究重點實驗室 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150076；3哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150081

連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl)是我國的傳統(tǒng)中藥，早在《本草圖經(jīng)》中就有記載，其味苦，性微寒，歸肺、心、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，常用于風(fēng)熱感冒、溫病初起、溫?zé)崛霠I、高熱煩渴、熱淋尿閉、癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒和腫毒等癥，被譽(yù)為“瘡家圣藥”。主要分布于我國山西、陜西、山東、安徽西部、河南等地[1,2]。本課題組曾對連翹的化學(xué)成分進(jìn)行過系統(tǒng)的研究，從中得到了一系列結(jié)構(gòu)新穎且具有抗氧化、抗腫瘤和抗菌藥理活性的化合物[3-6]。本文對連翹的50%乙醇提取物經(jīng)多種柱色譜分離純化，從中分離得到了7個雙四氫呋喃木脂素類化合物，分別(+)-8-hydroxyepipinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside(1)、(+)-8-Hydroxyepipinoresin-ol-4′-O-β-D-glucopyranoside(2)、(+)-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷(3)、(+)-表松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷(4)、(+)-表松脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷(5)、(+)-phyllrin(6)和(+)-pinoresinol(7)。

長久以來，對于雙四氫呋喃木脂素類化學(xué)成分的相對構(gòu)型和絕對構(gòu)型的確認(rèn)一直是一個難點[7-8]，構(gòu)型上的微小差別可導(dǎo)致其活性的巨大差異，有文獻(xiàn)報道[4](+)-8-hydroxyepipinoresin-ol-4-O-β-D-glucopyranoside(1)對5種癌細(xì)胞(HL60、A549、Hep-3B、Colo-205和KB)具有顯著的細(xì)胞毒活性，其活性明顯好于陽性藥5-氟尿嘧啶(5-Fu)，且與紫杉醇活性相當(dāng)，對人肝癌細(xì)胞Hep-3B的細(xì)胞毒活性甚至強(qiáng)于紫杉醇(taxol)。雙四氫呋喃木脂素8位有羥基，7位處于e鍵，7′位處于a鍵，且糖處于4位可能是其具有抗腫瘤活性的條件，其余構(gòu)型均無活性。所以，立體構(gòu)型的確認(rèn)是判斷活性化合物的關(guān)鍵。13C NMR可以作為確定相對構(gòu)型和絕對構(gòu)型的有力工具[9]，本文通過對NMR數(shù)據(jù)的總結(jié)對7個雙四氫呋喃木脂素類化合物的13C NMR和CD特點進(jìn)行了總結(jié)，為該類成分結(jié)構(gòu)確認(rèn)提供理論依據(jù)。

1 儀器和材料

核磁共振波譜儀(Bruker AV 600 NMR spectrometer，TMS 做內(nèi)標(biāo))；紫外光譜儀(SHIMADZU UV1700)；CD光譜儀(Bio-LogicMOS 450)HR-ESI-TOF-MS(Bruker Co.，Karlsruhe，Germany)。高效液相色譜儀(HITACHI，檢測器655 variable wavelenth UV Monitor；Waters，檢測器2489 UV/Visible Detector)；制備色譜柱(YMC ODS-A，5 μm，250×10 mm)；分析色譜柱(YMC ODS-A，5 μm，150×4.6 mm)。柱色譜硅膠(100～200目，200～300目，青島海洋化工廠)；薄層色譜硅膠H(300～400目)；GF254(青島海洋化工廠)；ODS柱色譜填料(60～80 μm,德國Merck)；Sephadex LH-20(北京綠百草)；AB-8大孔吸附樹脂(中國滄州)。

連翹藥材：2009年購于河北安國藥材公司(產(chǎn)地：山西)，經(jīng)鑒定為Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實。

2 提取與分離

中藥連翹(F.suspensa)的干燥果實8.3 kg，以50%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，濃縮得到的浸膏(出膏率約等于6.51%)依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，減壓回收溶劑得氯仿層40 g、乙酸乙酯層100 g、正丁醇層350 g。

圖1 化合物1～7的化學(xué)結(jié)構(gòu)

正丁醇層(350 g)部分以適量水溶解后用大孔吸附樹脂柱色譜分離，依次用純水，體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%和95%的乙醇-水梯度洗脫。其中體積分?jǐn)?shù)20%乙醇部分(40 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用CH2Cl2-MeOH(體積分?jǐn)?shù)100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、8∶1、5∶1)進(jìn)行梯度洗脫，得到流分Fr.1～Fr.7。經(jīng)過反復(fù)Sephadex LH-20柱色譜，硅膠柱色譜，聚酰胺柱色譜并結(jié)合半制備液相分離純化得到化合物1～7(圖1)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1～7的13C NMR數(shù)據(jù)如表1。

表1 化合物1～7的13C NMR光譜數(shù)據(jù)(150 MHz，DMSO-d6)

4 討論

連翹中含有大量木脂素類成分，2015版《國家藥典》規(guī)定將雙四氫呋喃木脂素成分連翹苷作為連翹質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[10]。雙四氫呋喃木脂素類化合物苷元母核結(jié)構(gòu)中共有4個手性碳，但8位和8′位均以cis駢合[11]。故苷元結(jié)構(gòu)中包含3個手性，構(gòu)型有8種同分異構(gòu)體[12]。

H-7和H-7′為(R，R)構(gòu)型時(虛線表示)，該化合物旋光值通常為(+)，在CD譜中，235和280 nm下為(+)的Cotton效應(yīng)；反之，H-7和H-7′為(S，S)構(gòu)型時(實線表示)，該化合物旋光值通常為(-)，在CD譜中，235和280 nm下為(-)的Cotton效應(yīng)。連翹中的化合物的旋光值均為右旋(圖2)。

圖2 雙四氫呋喃木脂素類的Cotton效應(yīng)

在13C NMR(DMSO-d6)譜中，對于苯環(huán)取向(直立或平伏鍵)不同時，C-7/C-7′和C-8/C-8′的化學(xué)位移明顯不同，可以作為判斷苯環(huán)取向的特征，而且不受苯環(huán)上取代基的影響。4(4′)位為羥基時，當(dāng)苯環(huán)處于平伏鍵(虛線)時，對應(yīng)的C-1位上的δC為132.3左右；直立鍵(實線)對應(yīng)的δC為129.0左右。當(dāng)4位羥基被甲氧基取代，1位碳化學(xué)位移+1.6；羥基成苷1位碳化學(xué)位移+3.0左右[11]。當(dāng)8或8′位被羥基取代，其對應(yīng)的1位C的化學(xué)位移向高場方向移動(-4.0)(圖3)。當(dāng)1位和1′位苯環(huán)均處在直立鍵時，Cotton效應(yīng)消失(圖4)[12,13]。

圖3 取代基的不同對C-1、C-1′化學(xué)位移值的影響

圖4 當(dāng)1/1′位為a鍵時無CE

連翹中含有大量四氫呋喃型木脂素，該類化合物遇到酸堿條件容易發(fā)生立體異構(gòu)化(a鍵與e鍵互換)：是由于呋喃環(huán)上的氧原子與苯甲基相連，容易開環(huán)，重復(fù)閉環(huán)時發(fā)生構(gòu)型變化[14](圖5)。

圖5 四氫呋喃型木脂素遇到酸堿條件容易發(fā)生立體異構(gòu)化

雙四氫呋喃木脂素結(jié)構(gòu)中手型碳較多，其構(gòu)型的確定一直以來是個難點問題。本文總結(jié)了13C NMR譜和CD譜的相關(guān)數(shù)據(jù)，通過總結(jié)發(fā)現(xiàn)具有一定的規(guī)律，對今后確認(rèn)連翹中的此類化合物以及其他植物中此類化合物的絕對構(gòu)型具有借鑒意義。