邱天雯,張東東,施銀仙,龍美芝,李建文,王躍虎,楊雪飛,3*,易 平
1中國科學院昆明植物研究所 資源植物與生物技術(shù)重點實驗室,昆明 650201;2中國科學院大學,北京 100049;3中國科學院東南亞生物多樣性研究中心,耶津 05282;4貴州醫(yī)科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室;5貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室/貴州省天然藥物工程研究中心,貴陽 550014;6百色學院,百色 533000
白刺花Sophoradavidii(Franch.)Skeels.(異名:SophoraviciifoliaHance.)為豆科(Leguminosae)蝶形花亞科槐屬植物,又叫苦刺花、狼牙刺、馬蹄針等。廣布于陜西、甘肅、河南、江蘇、浙江、湖北、湖南、廣西、四川、貴州、云南、西藏等地,生長于海拔2 500 m以下的河谷沙丘和山坡路邊的灌木叢中。其花蕾在民間廣泛食用,根據(jù)民間知識及藥典,其花可用于盜汗、中暑,可治療咽喉腫痛、臃腫瘡毒、尿血便血等,具有清熱解毒、涼血消腫的功效[1-3]。前人曾報道白刺花具有抗腫瘤[4]、抗菌[5]、抗炎、抗過敏[6]、抗病毒[7]和抗氧化[8]等多種藥理活性。目前國內(nèi)外對白刺花的研究主要集中在根、種子的化學成分和花正丁醇萃取部位的化學成分,尚未開展對白刺花花部位的二氯甲烷萃取部位化學成分的系統(tǒng)研究。此外,有研究表明同屬植物山豆根(S.tonkinensisGagnep.)的乙醇提取物具有較強的丁酰膽堿酯酶抑制活性,其中主要的化學成分為苦參堿型生物堿[9];同時有研究表明苦參堿可抑制乙酰膽堿酯酶/丁酰膽堿酯酶活性起神經(jīng)保護作用,有潛力發(fā)展為治療阿爾茲海默癥的新型藥物[10]。本研究對白刺花花蕾二氯甲烷萃取部位展開系統(tǒng)分析,以探明其生物堿成分及其抑制丁酰膽堿酯酶的生物活性。
JASCO P-1020型全自動數(shù)字旋光儀測量比旋光度;Shimadzu UV-2401PC分光光度計測量UV光譜數(shù)據(jù);JASCO J-815圓二色光譜儀測量CD光譜;Bruker Avance 500、600和800 NMR獲得1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù),化學位移的單位為δ(ppm),偶合常數(shù)(J)的單位為Hz;Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF測量ESI-MS和HR-ESI-MS數(shù)據(jù)。柱層析材料包括正相硅膠G(80~100目,300~400目,青島海洋化工廠)、正向硅膠H(HG/T2354-2010,青島海洋化工廠)、反相硅膠RP-C18(40~75 μm,日本Fuji Silysia化學公司)和葡聚糖凝膠SephadexTMLH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)。Agilent 1200半制備液相色譜儀(美國安捷倫公司),配備色譜柱Agilent Zorbax SB-C18柱(5.0 μm,Φ9.4×250 mm,美國)、Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱(4 μm,Φ4.6×100 mm,美國)、YMC-Pack ODS-A柱(5.0 μm,Φ10×250 mm,AA12S05-2510WT)和XbridgeTMC18柱(5 μm,Φ4.6×150 mm,愛爾蘭),用于化合物的半制備。
實驗常用試劑如甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇等均為工業(yè)級試劑,需重蒸處理。半制備液相和制備液相所用有機試劑為色譜純甲醇和乙腈。核磁所用氘代試劑為美國CIL公司生產(chǎn)。丁酰膽堿酯酶抑制實驗的儀器及試劑均由中國科學院昆明植物研究所天然藥物活性篩選中心提供。
顯色劑:碘粉、10%濃硫酸-乙醇溶液、碘化鉍鉀顯色劑。
研究材料為白刺花(S.davidii)花蕾,于2017年3月采自云南省昆明市富明縣爛泥灣村。由中國科學院昆明植物研究所張宇工程師鑒定。憑證標本(No.EB012017001)保存于中國科學院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)重點實驗室。
將白刺花花蕾(7.4 kg)干燥粉碎,在60 °C下用90%乙醇超聲提取1小時,在45 °C下蒸干,得到1.7 kg粗提物浸膏。將其與水混合制成混懸液(2 L)并用石油醚萃取,然后用5% HCl將剩余的水層調(diào)節(jié)至pH2.0~3.0,用乙酸乙酯萃取后,將剩余的水層用10% NaOH堿化至pH9.0~10.0,并用二氯甲烷徹底萃取。將二氯甲烷萃取部位浸膏(64.0 g)用二氯甲烷-甲醇,100∶0,50∶1→0∶100梯度洗脫,最終得到6個部份(A~F)。將B(9.6 g)在反相硅膠柱上進行色譜分離,并用甲醇-水,10∶90→100∶0梯度洗脫,得到4個部分(B1~B6)。將B2(4.3 g)在硅膠柱上分離,用二氯甲烷-甲醇,100∶1洗脫,最終得到5個部分(B2-1~B2-5)。將B2-1(3.1 g),B2-2(0.6 g)和B2-4(0.5 g)在Sephadex LH-20柱(甲醇)上進行色譜分離,分別得到5、8和4個部分。B2-1-2(55.1 mg)通過半制備型HPLC柱(XBridge,C18,4.6×150 mm,MeOH-H2O = 43∶57,1 mL/min,波長210 nm)純化得到12(27.9 mg,tR=5.627 min)和7(7.6 mg,tR=11.967 min),B2-1-4(89.4 mg)通過半制備型HPLC柱(Agilent,C18,9.4×250 mm,MeCN-H2O = 35∶65,2 mL/min,波長210 nm)得到2(7.8 mg,tR=17.204 min)和5(78.4 mg,tR=32.124 min),B2-4-2(409.6 mg)通過半制備型HPLC柱(YMC-ODS-A,10×250 mm,MeOH-H2O = 30∶70,2 mL/min,波長203 nm)得到3(3.8 mg,tR=22.686 min),4(3.7 mg,tR=25.296 min),8(68.7 mg,tR=31.963 min)和6(62.7 mg,tR=42.500 min)。將C(0.6 g)在反相硅膠柱上進行色譜分離,并用甲醇-水,10∶90→100∶0梯度洗脫,得到4個部分(C1~C4)。將C1(0.17 g)、C3(0.13 g)和C4(0.09 g)在Sephadex LH-20色譜柱(甲醇)上進行色譜分離,分別得到3、6和3個部分。C3-2(89.0 mg)通過半制備型HPLC柱(YMC-ODS-A,10×250 mm,MeOH-H2O=25∶75,2 mL/min,波長210 nm)得到1(7.1 mg,tR=35.936 min),14(2.0 mg,tR= 22.686 min)和15(3.1 mg,tR=54.401 min)。將D(21.8 g)在反相硅膠柱上進行色譜分離,并用甲醇-水,10∶90→100∶0梯度洗脫,得到4個部分(D1~D6)。D1-3-2(154.5 mg)通過半制備HPLC柱(YMC-ODS-A,10×250 mm,MeOH-H2O = 25∶75,2 mL/min,波長為203 nm)得到13(24.1 mg,tR=40.902 min)。將E(3.3 g)在反相硅膠柱上進行色譜分離,并用甲醇-水,10∶90→100∶0梯度洗脫,得到4個部分(E1~E4)。E2-3(256.7 mg)通過HPLC柱純化(EC-C18,4.6×100 mm,MeOH-H2O = 27∶73,1 mL/min,波長203 nm)得到10(27.8 mg,tR=8.506 min),9(25.4 mg,tR=14.013 min)和11(10.5 mg,tR=19.521 min)。E3-1-2(46.8 mg)通過HPLC柱(EC-C18,4.6×100 mm,MeOH-H2O = 30∶70,1 mL/min,波長210 nm)得到16(7.6 mg,tR=26.193 min)。
用磷酸鹽緩沖液(每100 mL磷酸鹽緩沖液中含0.1 M Na2HPO4溶液 94.7 mL;0.1 M NaH2PO4溶液 5.3 mL,調(diào)pH至8.0)將丁酰膽堿酯酶稀釋成0.04 U/mL;接著碘化硫代丁酰膽堿和DTNB用磷酸鹽緩沖液配成6.25 mM的溶液(工作液);接著化合物用DMSO稀釋成1 mM工作液,保證不同濃度的化合物溶液中DMSO濃度相同(均為2%),DMSO在最終反應體系中的終濃度為0.1%,化合物終濃度為50 μM。陽性對照為他克林,終濃度為0.333 μM;陰性對照組(NC組)為2% DMSO溶劑對照。反應在96孔板中進行,向96孔板中依次加入pH為8.0的磷酸緩沖液、2% DMSO、他克林溶液、樣品溶液和丁酰膽堿酯酶(加入試劑的體積為一個反應的體積),每個樣品做3個重復。加入顯色劑和底物后1小時內(nèi),每30秒鐘檢測一次405 nm吸光值。選擇NC組吸光值平均值約為1 h的樣品吸光值,計算化合物吸光值平均值(化合物測定值-背景值),并按照(NC-化合物吸光值平均值)/NC×100%來計算化合物丁酰膽堿酯酶抑制率。
化合物經(jīng)構(gòu)象搜索后,最優(yōu)構(gòu)象用gaussian16的b3lyp/6-311+g(d,2p)基組進行構(gòu)象優(yōu)化,確定無虛頻后,得到的構(gòu)象用gaussian16的cam-b3lyp/tzvp基組進行ECD圖譜計算[11]。
從白刺花花蕾二氯甲烷萃取部位分離得到16個化合物(圖1),其中化合物1為一個新的生物堿。根據(jù)化合物1的13C NMR數(shù)據(jù)(表1),以及高分辨電噴霧電離質(zhì)譜(HR-ESI-MS)顯示出[M + Na]+峰m/z303.167 8[M + Na]+(calcd for C15H24N2NaO3,303.167 9),推測其分子式為C15H24N2O3。其NMR數(shù)據(jù)(表1)顯示,該化合物存在一個羰基(δC171.8)、8個亞甲基和6個次甲基。對比化合物1和苦參堿(7)及其羥基取代物(8與9)NMR數(shù)據(jù)[12-14],推測化合物1是苦參堿的二羥基取代物。通過在該化合物COSY波譜中觀察到的相關(guān)(圖2),可以得到除C-15以外的所有碳原子的連接。通過HMBC相關(guān)(圖2),如從H2-2到C-4和C-6,H2-10到C-6和C-8,H2-17到C-6、C-11和C-15,H2-12到C-14,以及H2-13到C-15的相關(guān),再結(jié)合COSY片段,可以推斷出化合物具有9,14-二羥基苦參堿的平面結(jié)構(gòu)。其相對構(gòu)型通過ROESY相關(guān)(圖2)和氫原子之間的偶合常數(shù)來判斷。假定H-14取向為α,從H-14/H-12α,H-12β/H-9,H-9/H-11,以及H-11/H-17β等的相關(guān)中,可以推斷H-9和H-11為β取向,9-OH為α取向。因為H-9跟H-10α的偶合常數(shù)(J9,10α= 10.4 Hz)比較大,所以推測H-9和H-10α具有反式二直立鍵關(guān)系;同理,H-17β和H-5(J5,17β= 13.0 Hz)也具有反式二直立鍵關(guān)系,從而得出了H-10α和H-5均為α取向。在化合物1的ROESY譜中,H-10α跟H-6有相關(guān),說明H-6為α取向;H-5和H-7有相關(guān),說明H-7為α取向。這樣,就建立起化合物1的相對構(gòu)型,如圖2所示。而該化合物實驗的電子圓二色譜(electronic circular dichroism,ECD)跟理論計算的(5S,6S,7R,9S,11R,14S)-1的ECD圖譜基本吻合(圖3),因此確定了化合物1的絕對構(gòu)型?;衔?的詳細結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。
圖1 白刺花中化合物1~16的化學結(jié)構(gòu)
化合物2白色針晶(CHCl3);ESI-MS:m/z267[M + Na]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.28(1H,dd,J= 8.9,7.3 Hz,H-13),6.44(1H,dd,J= 9.0,1.1 Hz,H-14),6.22(1H,d,J= 7.2 Hz,H-12),4.18(1H,dd,J= 15.1,6.9 Hz,H-17),3.81(1H,dd,J= 15.0,12.4 Hz,H-17),2.89~1.44(15H,m);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:164.1(C-15),148.1(C-11),138.4(C-13),116.5(C-14),103.3(C-12),60.5(C-6),56.8(C-2),56.6(C-10),43.6(C-17),38.5(C-7),32.1(C-5),28.1(C-8),27.0(C-4),21.2(C-9),20.4(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15,16]報道對照基本一致,故鑒定該化合物為槐胺堿。
圖2 化合物1關(guān)鍵的2D NMR相關(guān)
圖3 化合物1實驗和計算的ECD圖譜
表1 化合物1的核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(600和150 MHz,δ in ppm,J in Hz)
化合物4無色晶體(CHCl3);ESI-MS:m/z283[M + Na]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.32(1H,dd,J= 9.0,7.1 Hz,H-13),6.52(1H,dd,J= 9.0,1.1 Hz,H-12),6.45(1H,dd,J= 7.1,1.1 Hz,H-14),4.16(1H,dd,J= 15.2,7.2 Hz,H-17β),3.77(1H,dd,J= 15.2,12.3 Hz,H-17α);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:163.7(C-15),148.1(C-11),138.5(C-13),118.9(C-14),103.2(C-12),69.6(C-7),66.3(C-6),56.5(C-2),56.1(C-10),43.7(C-17),37.3(C-8),26.5(C-4),25.8(C-5),22.3(C-9),20.1(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道對照基本一致,故鑒定該化合物為7α-羥基槐胺堿。
化合物5無色菱形晶體(CHCl3);ESI-MS:m/z269[M + Na]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:6.57~6.29(1H,m,H-13),5.86(1H,dt,J= 9.8,1.9 Hz,H-14),4.10(1H,dd,J= 13.0,4.7 Hz,H-17α),3.95(1H,dd,J= 16.9,9.7 Hz,H-11),3.14(1H,t,J= 12.8 Hz,H-17β),2.81(1H,d,J= 11.2 Hz,H-2β),2.76(1H,d,J= 11.2 Hz,H-10β),2.63~2.51(1H,m,H-6),2.23~2.12(1H,m),2.08(1H,s),1.36~1.93(12H,m);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:165.7(C-15),137.5(C-13),124.6(C-14),63.5(C-6),57.3(C-10),57.2(C-2),51.4(C-11),42.0(C-17),41.5(C-7),34.6(C-5),27.7(C-4),27.4(C-12),26.6(C-8),21.1(C-3),20.7(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道對照基本一致,故鑒定該化合物為槐果堿。
化合物9白色結(jié)晶(CHCl3);ESI-MS:m/z287[M + Na]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:4.31(1H,dd,J= 12.8,4.3 Hz,H-17),4.18(1H,d,J= 3.6 Hz,H-13),4.01(1H,td,J= 9.8,5.7 Hz,H-11),3.06(1H,t,J= 12.7 Hz,H-17),2.80(1H,d,J= 11.2 Hz,H-2),2.75(1H,d,J= 11.4 Hz,H-10),2.55~2.41(1H,m,H-14),2.14(1H,td,J= 11.4,5.3 Hz,H-6),2.08(1H,s,H-12),2.00~1.81(3H,m,H-2,H-8,H-10),1.76~1.57(4H,m,H-3,H-4,H-5,H-9),1.57~1.24(6H,m,H-3,H-4,H-7,H-8,H-9,H-12);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:167.9(C-15),63.6(C-6),62.3(C-13),57.2(C-2),57.1(C-10),49.6(C-11),43.0(C-7),41.3(C-17),40.5(C-14),35.3(C-5),33.4(C-12),27.7(C-4),26.5(C-8),21.1(C-9),20.6(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道對照基本一致,并根據(jù)NMR一維和二維數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù),故鑒定該化合物為13α-羥基苦參堿,即苦丁堿。
化合物10無色固體;ESI-MS:m/z285[M + Na]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:4.26(1H,d,J= 11.3 Hz,H-17),3.73~3.59(1H,m,H-9),3.16~3.01(2H,m,H-10,H-17),2.86~2.77(1H,m,H-8),2.73(1H,d,J= 10.1 Hz,H-2),2.68~2.58(1H,m,H-12),2.50~2.37(1H,m,H-14),2.33~2.12(3H,m,H-6,H-10,H-12),2.11~1.97(1H,m,H-2),1.97~1.75(4H,m,H-4,H-5,H-8,H-13),1.78~1.64(3H,m,H-3,H-4,H-13),1.54~1.38(1H,m,H-3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:168.8(C-15),130.3(C-11),111.8(C-7),67.3(C-9),64.2(C-10),60.7(C-6),55.3(C-2),40.8(C-17),38.6(C-8),32.7(C-14),31.9(C-5),26.8(C-4),24.7(C-12),21.6(C-3),19.5(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道對照基本一致,故鑒定該化合物為9α-羥基-7,11-脫氫苦參堿。
化合物11白色針晶(CHCl3);ESI-MS:m/z271[M + Na]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:3.41(1H,dd,J= 13.4,5.5 Hz,H-17),3.33(1H,ddd,J= 10.3,7.5,5.4 Hz,H-11),3.29~3.20(1H,m,H-17),2.88~2.79(1H,m,H-2a),2.75(1H,ddd,J= 11.8,8.9,4.4 Hz,H-10a),2.45~2.24(3H,m,H-6,H2-14),2.23~2.07(2H,m,H-2b,H-10b),1.94~1.85(2H,m,H-3a,H-5),0.97~1.85(12H,m);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:170.0(C-15),63.3(C-6),55.9(C-2),55.7(C-11),50.3(C-10),47.6(C-17),40.9(C-7),32.5(C-14),30.8(C-5),30.2(C-12),28.1(C-4),23.7(C-3),21.7(C-8),21.5(C-9),18.9(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16,20]報道對照基本一致,故鑒定該化合物為槐定堿。
化合物14白色粉末;ESI-MS:m/z353[M + Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.91(2H,m,H-2,H-6),6.85(1H,d,J= 8.5 Hz,H-5),4.86(1H,d,J= 11.5 Hz,H-7a),4.57(1H,d,J= 11.5 Hz,H-7b),4.43(1H,d,J= 7.8 Hz,H-1′),3.95(1H,dd,J= 11.7,3.7 Hz,H-6′a),3.90(3H,s,OMe),3.89(3H,s,OMe),3.85(1H,dd,J= 11.8,4.8 Hz,H-6′b);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:149.3(C-3),149.2(C-4),129.2(C-1),121.0(C-6),111.6(C-5),111.0(C-2),101.5(C-1′),76.3(C-3′),75.3(C-5′),73.8(C-2′),71.6(C-7),70.7(C-4′),62.6(C-6′),56.0(OMe),56.0(OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]報道對照基本一致,故鑒定該化合物為3,4-二甲氧基苯甲醇7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物15無色膠狀體;ESI-MS:m/z307[M + Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.30~7.24(5H,m,H-2,H-3,H-4,H-5,H-6),4.30(1H,d,J= 7.6 Hz,H-1′),4.12(2H,m,H-2"),3.95(1H,dd,J= 11.7,5.1 Hz,H-6′a);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:138.3(C-1),128.9(C-3,C-5),128.5(C-2,C-6),126.5(C-4),102.8(C-1′),76.2(C-3′),75.4(C-5′),73.7(C-2′),70.9(C-2"),70.2(C-4′),62.1(C-6′),36.1(C-1")。以上數(shù)據(jù)與文獻[24]報道對照基本一致,故鑒定該化合物為2-苯乙基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物16白色粉末;ESI-MS:m/z603[M + Na]+;1H NMR(800 MHz,CD3OD)δ:6.72(2H,s,H-2′,H-6′),6.65(2H,s,H-2,H-6),4.77(1H,d,J= 4.3 Hz,H-7′),4.72(1H,d,J= 4.5 Hz,H-7),4.34~4.24(2H,m,H-9a,H-9′a),3.96~3.88(2H,m,H-9b,H-9′b),3.86(6H,s,3-OMe,5-OMe),3.84(6H,s,3′-OMe,5′-OMe),3.77(1H,dd,J= 12.0,2.3 Hz,glc-6a),3.66(1H,dd,J= 12.0,5.2 Hz,glc-6b),3.60~3.53(1H,m,glc-2),3.53~3.44(1H,m,glc-5),3.44~3.36(1H,m,glc-4),3.26~3.08(3H,m,glc-3,H-8,H-8′);13C NMR(200 MHz,CD3OD)δ:154.4(C-3′,C-5′),149.4(C-3,C-5),139.6(C-1′),136.2(C-4),135.6(C-4′),133.1(C-1),105.3(glc-1),104.8(C-2,C-6),104.5(C-2′,C-6′),87.6(C-7′),87.2(C-7),78.4(glc-3),77.8(glc-5),75.7(glc-2),72.9(C-9′),72.9(C-9),71.3(glc-4),62.6(glc-6),57.1(3′-OMe,5′-OMe),56.8(3-OMe,5-OMe),55.7(C-8),55.5(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[25]報道對照基本一致,故鑒定該化合物為丁香脂素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
對白刺花花蕾二氯甲烷萃取部位和從該萃取部位分離得到的16個單體化合物進行了體外丁酰膽堿酯酶抑制活性測試,結(jié)果表明二氯甲烷萃取部位(濃度20 μg/mL)及苦參堿(濃度50 μM)具有一定的抑制丁酰膽堿酯酶活性,抑制率分別為31%和35%。其他化合物活性較低。
表2 白刺花二氯甲烷萃取部位及其化合物對丁酰膽堿酯酶的抑制活性
注:*陽性對照。
Note:*Positive control.
本研究從白刺花花蕾二氯甲烷萃取部位分離鑒定了16個單體化合物,其中包括11個苦參堿型生物堿(1~11)、2個鷹爪豆堿型生物堿(12和13)、2個黃酮類化合物(14和15)及1個木脂素類化合物(16),包括1個新化合物1。其中,化合物1、3、4、10、13~16,共8個化合物首次從白刺花中獲得?;衔?、9和12,共3個化合物首次從白刺花的花部位獲得。
本研究共分離得到11個苦參堿型生物堿和2個鷹爪豆堿型生物堿,總堿成分及苦參堿(7)對丁酰膽堿酯酶具有一定的抑制活性,有潛力成為治療阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病的新型藥物資源。研究豐富了白刺花花部位的化學成分,解析了民間食用喜好背后的物質(zhì)基礎(chǔ),為其藥物研發(fā)提供了科學依據(jù)。