王 藝，魏 華，楊 光，張 梅

石河子大學(xué)藥學(xué)院 新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000

癌癥，又稱惡性腫瘤，是嚴(yán)重危害人類健康、導(dǎo)致現(xiàn)代人類死亡的第一大惡疾和頑癥。近20年，我國(guó)的惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，目前國(guó)內(nèi)多數(shù)腫瘤患者，以中晚期居多，治愈率較低。世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果顯示，在世界范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。雖然對(duì)細(xì)胞癌變機(jī)制的認(rèn)識(shí)在不斷深入，然而人們?cè)诳刂瓢┌Y的征途中步履維艱，進(jìn)展緩慢，人類將面臨著防治惡性腫瘤的新挑戰(zhàn)[1]。惡性腫瘤的治療方法早期多以手術(shù)為主，但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)。放療等其他方法療效均不理想，且副作用大。所以，臨床上藥物治療仍為多數(shù)病人不可缺少的治療手段。因此，尋找新的抗癌藥物并探討其分子機(jī)制是目前癌癥防治措施的研究重點(diǎn)。

桑樹(shù)中有抗癌作用的黃酮類化合物，其特有的Diels-Alder型加合物，以桑根酮D(sanggenon D)含量較高。藥理學(xué)研究證實(shí)該單體具有明顯的降壓、抗炎作用，但其抗癌作用研究鮮有報(bào)道。目前，國(guó)外僅證明這種化合物對(duì)PKC、ODC和COX-1等癌癥相關(guān)因子有抑制作用，國(guó)內(nèi)主要研究該單體的提取工藝[2-5]。本課題前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桑根酮C(是桑根酮D的同分異構(gòu)體)能抑制多種人腫瘤細(xì)胞，尤其對(duì)肝癌細(xì)胞最為敏感[6]。本研究開(kāi)展了桑根酮D體內(nèi)外抗癌活性的研究，旨在探究桑樹(shù)中抗癌活性成分，發(fā)現(xiàn)更好的抗癌藥物，為藥用植物黑桑的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 3131)，超凈工作臺(tái)(ZHJH-1112B)，蔡司熒光倒置顯微鏡(MIC00266)，酶標(biāo)儀(Thermo 3001)，普通生物倒置顯微鏡(BDS200-PH)，電子天平(AR-2140 型)，MH-2微量振蕩器，HH.S精密恒溫水浴鍋，離心機(jī)(TGL 16 M)，超聲波清洗器，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，超低溫冰箱，4 ℃冰箱等。

1.2 樣品與試劑

桑根酮D(英文名稱：sanggenon D；純度：HPLC>98%；CAS號(hào)：81422-93-7；分子量：708.70；分子式：C40H36O12；產(chǎn)品貨號(hào)：HS052274，購(gòu)于寶雞市辰光生物科技有限公司)，5-氟尿嘧啶(美侖生物)，1640(HyClone)，PBS，0.4%SRB溶液，胰蛋白酶(BOSTRE)，小鼠黑色素瘤B16F0細(xì)胞、小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))，小鼠肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞株(北京協(xié)和細(xì)胞資源庫(kù))，昆明種(KM)小鼠(石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%血清和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞、小鼠黑色素瘤B16F0細(xì)胞、B16F10細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞增殖測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F0細(xì)胞、B16F10細(xì)胞、HepG2細(xì)胞分別按照2×104、3×104、8×104個(gè)/mL濃度接種于96孔板(180 μL/孔)，24 h后，加入不同濃度的桑根酮D和5-FU處理細(xì)胞，48 h后采用SRB法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.3.3 黑色素含量的測(cè)定

按照Vandana法，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F0、B16F10細(xì)胞以1.0×105個(gè)/孔鋪于6孔板中，加入三個(gè)濃度的桑根酮D(20、40、80 μmol/L)，24h后，PBS洗2次，用0.25%的胰酶消化收集于離心管，再次用PBS洗一次并倒入離心管，3 500 rpm離心5 min，收集上清液，取1 mL上清液加入1 mL 0.4 M HEPES buffer(pH 6.8)和1 mL乙醚∶乙醇=1∶1(V∶V)，取下層水相，于405 nm測(cè)定細(xì)胞外吸光度(A)；取細(xì)胞沉淀，細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入含10%DMSO-NaOH 1.5 mL于80 ℃煮1 h，3 500 rpm離心10 min，取上清液，于405 nm測(cè)定細(xì)胞內(nèi)吸光度(A)。

1.3.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F0、HEPG2、B16F10單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，將B16F0、HEPG2細(xì)胞懸浮在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中備用，B16F10懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。將細(xì)胞以每孔100個(gè)/mL的濃度接種于6孔板中，24 h后加入不同濃度的桑根酮D(5、10、20、40、80 μmol/L)，置37 ℃、5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)7天。在蔡司熒光倒置顯微鏡下觀察集落形成情況并拍照。終止培養(yǎng)棄去上清，用PBS潤(rùn)洗2次，用甲醇固定10 min后，棄固定液用Giemsa應(yīng)用染色液染10 min后，用PBS沖洗多余染液，空氣干燥。拍照并計(jì)算肉眼可見(jiàn)的集落數(shù)，最后計(jì)算克隆形成率。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞按5×108/L的密度接種于6孔板內(nèi)，加入不同濃度的桑根酮D，培養(yǎng)24 h。離心收集細(xì)胞1×105～5×105。加入300 μL Binding buffer，再加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V，室溫混勻并避光30 min，然后加入PI，避光反應(yīng)5 min。上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞移植動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)的影響

取KM鼠，制備H22小鼠肝癌單細(xì)胞懸液，每只小鼠腋窩皮下接種2×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液(0.2 mL/只)。在接種后第一天開(kāi)始給藥，將動(dòng)物隨機(jī)分5組，為模型組、5-FU組(20 mg/kg)、桑根酮D低(12.5 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)劑量組，連續(xù)腹腔注射桑根酮D 10天。末次給藥后24h，處死動(dòng)物，剝離瘤組織并稱重，通過(guò)計(jì)算得抑瘤率?？疾焐８狣對(duì)肝癌移植瘤的抑制作用。

1.3.7 對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

1.3.6 項(xiàng)中，剝離瘤組織后，取小鼠心、肝、腎、脾等臟器并稱重，通過(guò)計(jì)算得臟器指數(shù)?？疾焐８狣對(duì)荷瘤小鼠各臟器的毒性。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 桑根酮D對(duì)B16F0細(xì)胞、B16F10細(xì)胞、HepG2細(xì)胞增殖抑制作用

SRB檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1A、B、C)，5、10、20、40、80 μmol/L的桑根酮D和5-FU分別作用于B16F0細(xì)胞、B16F10細(xì)胞、HepG2細(xì)胞48h后，細(xì)胞增殖均被抑制，且隨著桑根酮D和5-FU濃度升高，增殖抑制作用增強(qiáng)。與空白組比較，均有顯著性差異(P<0.01)。計(jì)算得桑根酮D對(duì)B16F0細(xì)胞、B16F10細(xì)胞、HepG2細(xì)胞的IC50分別為26.71±0.2 μmol/L、40.46±0.03 μmol/L、22.61±0.26 μmol/L。此結(jié)果表明桑根酮D對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)。

圖1 桑根酮D抑制細(xì)胞增殖

2.2 桑根酮D促進(jìn)細(xì)胞黑色素生成

處理細(xì)胞24 h后，不同濃度的桑根酮D均可使B16F0、B16F10細(xì)胞外(圖2A、2C)與細(xì)胞內(nèi)(圖2B、2D)黑色素生成增加(P<0.01)。生成的黑色素越多，表明細(xì)胞的分化程度越高。胞內(nèi)和胞外的黑色素含量與對(duì)照組相比均升高，且成劑量依賴性，可見(jiàn)10、20、40 μmol/L的桑根酮D可以使B16F0、B16F10細(xì)胞分化，惡化程度降低。

2.3 桑根酮D抑制細(xì)胞克隆

桑根酮D處理B16F0、B16F10細(xì)胞后，細(xì)胞集落數(shù)減少，抑制其生長(zhǎng)。從圖3A可以看出并計(jì)數(shù)，B16F0細(xì)胞對(duì)照組的集落數(shù)為71個(gè)，5、10、20、40 μmol/L的SD組形成的集落數(shù)為43、33、17、15個(gè)。從圖3B可以看出，B16F10細(xì)胞對(duì)照組的集落數(shù)為88個(gè)，5、10、20、40 μmol/L SD組形成的集落數(shù)為70、62、45、7個(gè)。同樣，桑根酮D處理的HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3C，對(duì)照組集落數(shù)64個(gè)，而5、10、20、40 μmol/LSD組形成集落數(shù)為53、51、29、13個(gè)，其形成的集落的個(gè)數(shù)均少于對(duì)照組的克隆數(shù)，增殖能力下降，集落形成能力也減弱，說(shuō)明較高濃度的桑根酮D抑制HepG2生長(zhǎng)。

2.4 桑根酮D對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

正常組HepG2腫瘤細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大小均勻，細(xì)胞核清楚可見(jiàn)，且均呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，少有懸浮細(xì)胞存在。其他SD各組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積變小，細(xì)胞間隙增加，貼壁細(xì)胞減少，部分細(xì)胞脫落懸浮在培養(yǎng)液中，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.5 桑根酮D誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

桑根酮D對(duì)細(xì)胞凋亡的影響(圖5a、b、c、d)。5、10、20 μmol/L的桑根酮D處理HepG2細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率分別為：7.12%±0.98%、8.09%±1.4 %、11.07%±1.17%(圖5e)。與陰性對(duì)照組比較，三個(gè)濃度的桑根酮D誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 桑根酮D對(duì)黑色素瘤細(xì)胞中黑色素生成的影響

圖3 桑根酮D對(duì)細(xì)胞克隆的影響

圖4 不同濃度的SD對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

圖5 桑根酮D對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

2.6 桑根酮D抑制移植瘤生長(zhǎng)

建立小鼠H22腫瘤模型，分為模型組、桑根酮D低劑量組(SD-L，12.5 mg/kg)、桑根酮D中劑量組(SD-M，25 mg/kg)、桑根酮D高劑量組(SD-H，50 mg/kg)和5-氟尿嘧啶陽(yáng)性組(5-FU，20 mg/kg)，除模型組外其余組腹腔注射給藥。桑根酮D對(duì)小鼠的體重影響不大(圖6)，與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，說(shuō)明桑根酮D對(duì)小鼠的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。高中低三個(gè)劑量組的桑根酮D均具有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用(圖7和圖8)，且在該劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(表1)。桑根酮D對(duì)小鼠H22腫瘤的抑制率為32.51%～45.72%。

表1 桑根酮D對(duì)小鼠H22腫瘤的抑制作用及其對(duì)荷瘤小鼠生長(zhǎng)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with control,*P< 0.05;**P<0.01.

圖6 桑根酮D對(duì)荷瘤小鼠生長(zhǎng)的影響

2.7 桑根酮D對(duì)小鼠臟器的毒性研究

肝臟指數(shù)結(jié)果顯示(圖9)，桑根酮D組均小于陽(yáng)性對(duì)照組和模型組，與空白組相近。對(duì)于腎臟指數(shù)，與模型組比較，中、高劑量桑根酮D具有顯著性差異(P<0.05)。桑根酮D對(duì)心臟的影響(圖10)，與模型組比較，中、高劑量桑根酮D組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與正常組比較，心臟指數(shù)變化不大。脾臟指數(shù)變化結(jié)果(圖10)，高、中、低三個(gè)劑量的脾臟指數(shù)比正常組大，但比模型組小(P<0.05)。毒理學(xué)中，臟器指數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等，臟器指數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變[5]。由此可見(jiàn)，桑根酮D對(duì)小鼠肝臟、脾臟、心臟、腎臟毒性小。

圖7 H22異種移植腫瘤組織

圖8 桑根酮D對(duì)小鼠H22腫瘤的抑制作用

圖9 桑根酮D對(duì)小鼠肝臟、腎臟的臟器指數(shù)的影響

3 討論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類健康和生命，已成為人類死亡的第一殺手。肝癌是我國(guó)高發(fā)腫瘤，且死亡率高、救治率低。雖然治療手段多，但化療藥物是必不可少的。目前臨床采用的化療藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)重、多，而且容易耐藥，導(dǎo)致預(yù)后效果差。這些現(xiàn)狀迫使尋找新的高效低毒的抗癌藥物成為防治癌癥的重點(diǎn)。

圖10 桑根酮D對(duì)小鼠心臟、脾的臟器指數(shù)的影響

桑白皮(Cortex Mori)是?？粕僦参颩orusalbaL.的干燥根皮。為中國(guó)藥典收載的常用中藥之一，具有瀉肺平喘、利水消腫功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，桑白皮降糖降脂主要藥效成分為桑白皮黃酮、生物堿及多糖類成分[9]，而桑根酮D和桑根酮C是桑樹(shù)中特有的黃酮結(jié)構(gòu)，在桑黃酮中含量高[6-8]。桑白皮具有抗癌、抗炎、降血壓、降血糖、和抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用，臨床可用于治療前列腺癌、“三高”等疾病[10-13]。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)桑白皮的甲醇提取物可抑制 NF-κB 而誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞的凋亡，而且可以靶向殺滅腫瘤干細(xì)胞[14,15]。

本研究發(fā)現(xiàn)桑根酮D抑制B16F0細(xì)胞、B16F10細(xì)胞、HepG2細(xì)胞增殖，桑根酮D對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞最為敏感。通過(guò)用肝癌細(xì)胞動(dòng)物模型來(lái)考察SD體內(nèi)抗癌作用，發(fā)現(xiàn)桑根酮D具有抑制移植瘤生長(zhǎng)的作用。這些結(jié)果顯示，桑根酮D具有體內(nèi)外抗肝癌的作用。而桑根酮D 對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響比模型組的要小，也比陽(yáng)性對(duì)照組5-FU對(duì)各臟器指數(shù)小。表明桑根酮D對(duì)小鼠脾臟、心臟、腎臟毒性小。本研究說(shuō)明桑根酮D作為抗癌候選化合物，具有毒性小的優(yōu)勢(shì)。

此外，桑根酮D促進(jìn)B16F0細(xì)胞黑色素生成，生成的黑色素越多，表明B16F0細(xì)胞的分化程度越高，說(shuō)明桑根酮D能使細(xì)胞分化，惡性程度降低，細(xì)胞往好的方向發(fā)展。結(jié)合對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的胞內(nèi)胞外黑色素含量的測(cè)定，黑色素含量是黑色素瘤分化能力的重要標(biāo)志[16]，藥物誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞分化為較成熟的上皮樣細(xì)胞的同時(shí)，黑色素的生成能力也增加，生成的黑色素越多，表明細(xì)胞的分化程度越高[17]，由于B16F0和B16F10細(xì)胞分化，其惡性程度降低，細(xì)胞會(huì)由低分化向成熟細(xì)胞分化。有效的誘導(dǎo)分化劑可使細(xì)胞的黑色素含量增加2倍以上[18-20]，提示桑根酮D有誘導(dǎo)B16F0和B16F10細(xì)胞向正常黑色素樣細(xì)胞分化的能力。但本研究結(jié)果顯示，桑根酮D具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化成正常細(xì)胞的能力。本研究還發(fā)現(xiàn)桑根酮D具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。

本實(shí)驗(yàn)只是初步探討了桑根酮D可誘導(dǎo)細(xì)胞分化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具體通過(guò)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還不清楚，需進(jìn)一步研究，桑根酮D是否可作為一種有效的輔助手段用于肝癌患者的治療，還有待更深入的研究。