曾露桂，羅倩，吳宇瑤，聶瓊，

(1.貴州大學農(nóng)學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

煙草是重要的模式作物，也是中國主要的經(jīng)濟作物之一。生物及非生物因素影響著煙草的生長發(fā)育，從而影響著煙葉的產(chǎn)量及品質(zhì)。干旱可使煙株呼吸作用、光合作用受到影響，直接導致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1]；土壤鹽分過高可導致煙株內(nèi)部離子失衡，多種生理代謝會出現(xiàn)不同程度紊亂，致使煙株發(fā)育不良[2]；低溫使煙草在苗期出現(xiàn)僵化苗和老化苗及早花現(xiàn)象，在成熟期致使光能利用率下降等[3]。在植物中，轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與生物脅迫(病害、蟲害等)和非生物脅迫(低溫、干旱、高溫等)應(yīng)答及生長發(fā)育調(diào)控，在植物信號傳導途徑中至關(guān)重要[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)植物響應(yīng)生物和非生物脅迫[5]，在植物抗逆方面發(fā)揮著重要作用[6]。MYC2轉(zhuǎn)錄因子是bHLH家族的重要成員，它是茉莉酸(Jasmonate，JA)信號通路中的主要調(diào)控因子之一[7]。JA可調(diào)控植物衰老、花藥開裂、根分化、植物受精、花青素累集等生長過程[8-9]。MYC2轉(zhuǎn)錄因子可通過形成COI1/JAZs / MYC2復合物，參與JA，ABA等激素信號的轉(zhuǎn)導過程[10-12]，并且在植物生命活動中起著重要的調(diào)控作用[13]。DOMBRECHT等[14]發(fā)現(xiàn)，MYC2不僅與G-box具有高親和，并還能與其突變體5′-CACATG-3′和5′-CACGTG-3′序列相結(jié)合。MYC2轉(zhuǎn)錄因子可正調(diào)控抗蟲基因、抗壞血酸合成關(guān)鍵酶基因、類黃酮合成關(guān)鍵基因和煙堿合成關(guān)鍵基因等，也可負調(diào)控自身的轉(zhuǎn)錄、Trp代謝途徑和IGs代謝合成途徑等[15]。MYC2轉(zhuǎn)錄因子還能響應(yīng)氧化、蟲害等逆境脅迫[7]。

目前，bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在煙草抗逆中的研究較為滯后，且關(guān)于煙草NtMYC2對非生物脅迫因素的響應(yīng)報道較少[16]。因此，本研究通過對煙苗進行激素誘導及非生物脅迫處理，運用RT-qPCR技術(shù)分析激素及非生物脅迫處理后煙草NtMYC2的表達情況；并利用在線軟件PlantCARE對NtMYC2啟動子區(qū)域的順式元件進行分析，為進一步探究NtMYC2參與調(diào)控煙草的抗逆功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

本試驗以自育煙草品系GDH88為材料，用漂浮盤進行育苗。待煙苗培養(yǎng)至五葉一心時，將漂浮盤置于清水中預處理3 d，再將煙苗分別置于50 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)(北京索萊寶科技有限公司)，100 μmol·L-1脫落酸(ABA)(北京索萊寶科技有限公司)，200 mmol·L-1NaCl和20 % PEG 6000(北京索萊寶科技有限公司)溶液中進行激素、高鹽及模擬干旱處理；將煙苗置于4 ℃光照培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗)中和28 ℃的光照培養(yǎng)箱(0 h光照/24 h黑暗)中分別進行低溫和黑暗處理；以置于清水中，28 ℃光照培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗)中培養(yǎng)的煙苗為對照；每個處理設(shè)置3個重復，每重復30株。在處理后0，1，3，6，12，24和48 h 時分別取各處理和對照煙株葉片，液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于RNA提取。

1.2 實時熒光定量表達分析

1.2.1 RNA提取 RNA提取按照寶生物工程(大連)有限公司MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒說明書進行，用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，紫外吸收法測定其含量[17]。

1.2.2 cDNA第一鏈合成及檢測 cDNA第一鏈合成參照寶生物工程(大連)有限公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進行；以煙草管家基因L25為內(nèi)參基因(引物序列如表1所示)進行PCR擴增，擴增體系為：5 μL Mix(天根生化科技(北京)有限公司)，2 μL cDNA，引物L25-F和 L25-R各0.5 μL，3.5 μL ddH2O；擴增程序為：94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA質(zhì)量。

1.2.3 實時熒光定量PCR 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列如表1所示。RT-qPCR采用寶生物工程(大連)有限公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒，反應(yīng)體系為：12.5 μL TB Green Premix Ex TaqⅡ，1 μL (10 μmol·L-1) NtMYC2-F，1 μL (10 μmol·L-1) NtMYC2-R，2 μL cDNA模板，8.5 μL 滅菌水；反應(yīng)程序為：95 ℃，30 s預變性；95 ℃，5 s，59.5 ℃，30 s，39個循環(huán)。各樣本設(shè)3次重復。

表1 RT-qPCR的引物序列 Table 1 Sequences for RT-qPCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS和Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；運用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線軟件進行啟動子分析。目的基因表達量采用相對定量法分析，參照2-ΔΔCt方法進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草葉片RNA檢測

提取各脅迫處理材料的RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。RNA 3條條帶清晰可見，且28 S的亮度為18 S的2倍，5 S的亮度較為微弱；經(jīng)紫外吸收法分析，吸收值(A260/A280)均為1.7～2.0；結(jié)果表明，提取的RNA完整性及純度較好，可進行cDNA第一鏈合成。

2.2 激素處理對煙草葉片NtMYC2表達的影響

如圖2 A所示，MeJA處理后NtMYC2的相對表達量整體呈先下降后上升的趨勢， 在24 h以前NtMYC2表現(xiàn)為下調(diào)響應(yīng)，在6 h時相對表達量顯著低于對照，為對照的0.29倍；但在24 h及之后NtMYC2的表達呈上調(diào)趨勢，且在48 h時相對表達量顯著高于對照，為對照的3.88倍。經(jīng)ABA處理(圖2 B)后發(fā)現(xiàn)，NtMYC2的相對表達量持續(xù)上調(diào)，整體上呈逐漸上升的趨勢，并且均顯著高于對照，48 h相對表達量最高，為對照的17.31倍。

M：2000相對分子質(zhì)量標準；1～12：隨機12個煙株葉片RNA。 M： DL 2000 DNA Maker; 1～12: RNA from random 12 tobacco leaves.

注：不同小寫字母表示差異達5%顯著水平。下同。Note: Different letters indicate significant difference at 5% level.The same as below.圖2 MeJA和ABA處理對煙草葉片NtMYC2相對表達量的影響 Fig.2 Effects of MEJA and ABA treatment on the relative expression of NtMYC2 in tobacco leaves

2.3 非生物脅迫處理對煙草葉片NtMYC2表達的影響

如圖3所示，NtMYC2的表達受高鹽、干旱、低溫和黑暗脅迫的誘導，但表達模式隨脅迫處理的不同而不同。鹽脅迫處理NtMYC2的相對表達量整體呈先上升后下降再上升的趨勢(圖3 A)，在1 ～ 3 h時表現(xiàn)上調(diào)響應(yīng)，且相對表達量顯著高于對照，在1 h時表達水平最高，為對照的3.95倍；在6 h時相對表達量顯著低于對照，為對照的0.66倍。在12～48 h時NtMYC2相對表達量與對照無顯著性差異。干旱脅迫處理NtMYC2的相對表達量呈先下降后上升再下降再上升的趨勢(圖3 B)，在48 h時NtMYC2的相對表達量顯著高于對照，為對照的2.79倍；在6 h時NtMYC2的相對表達量顯著低于對照，為對照的0.76倍。低溫脅迫處理NtMYC2的相對表達量呈先上升后下降的趨勢(圖3 C)，在1 ～ 24 h時NtMYC2均表現(xiàn)為上調(diào)趨勢，且相對表達量顯著高于對照；在6 h時相對表達量最高，為對照的14.38倍；在48 h時NtMYC2表現(xiàn)與對照無顯著關(guān)系，相對表達量為對照的0.74倍。黑暗處理后NtMYC2的相對表達量整體呈逐漸上升的趨勢(圖3 D)，處理1 h后NtMYC2均表現(xiàn)為上調(diào)響應(yīng)，且相對表達量顯著高于對照，在48 h時到達最高，為對照的8.35倍。

圖3 非生物脅迫對煙草葉片NtMYC2相對表達量的影響Fig.3 Effects of abiotic stress on the relative expression of NtMYC2 in tobacco leaves

2.4 煙草NtMYC2啟動子結(jié)合位點分析

從NCBI的煙草基因組數(shù)據(jù)庫中獲取NtMYC2起始密碼子上游2 000 bp的序列，并利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對其順式響應(yīng)元件進行分析。結(jié)果顯示，NtMYC2啟動子區(qū)域含有多種順式作用元件，其中有多個關(guān)于脅迫的響應(yīng)元件(表2)。關(guān)于光響應(yīng)元件的數(shù)量最多，如BOX4,GT1-motif,G-Box,I-box；同時還發(fā)現(xiàn)低溫響應(yīng)元件LTR ，干旱脅迫響應(yīng)元件MBS和CCAAT-Box，脫落酸反應(yīng)元件ABRE，防御與應(yīng)激反應(yīng)響應(yīng)元件TC-rich repeats，生長素響應(yīng)元件TGA-element，厭氧誘導元件ARE和增強誘發(fā)厭氧反應(yīng)的GC-motif等。表明NtMYC2的表達可能受光、低溫、干旱、激素及氧氣等條件的調(diào)控。

表2 煙草NtMYC2啟動子序列分析Table 2 NtMYC2 promoter sequence analysis of tobacco

續(xù)表2 Continuing table 2

3 結(jié)論與討論

MYC2轉(zhuǎn)錄因子是MYC家族中的重要成員之一，目前研究最為深入。有研究表明，茉莉酸能響應(yīng)重金屬離子、干旱、高鹽等環(huán)境脅迫，MYC2轉(zhuǎn)錄因子是大量JA信號通路分支的核心調(diào)控因子[7]，MeJA處理后，煙草葉片對蚜蟲的驅(qū)避作用明顯增強，還可抑制H2O2的積累，提高煙草的耐冷性[18-19]。大量研究發(fā)現(xiàn)，在MeJA處理后可提高煙葉煙堿含量[20]。趙虎等[21]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MeJA處理的小麥，TaMYC2的表達量顯著增加。本研究中，隨著MeJA處理時間的延長，NtMYC2的表達在6 h以前呈下降趨勢，之后又逐漸上升，在48 h時為對照的3.88倍。周莉等[22]發(fā)現(xiàn)，外源ABA可促進花色苷合成相關(guān)基因的表達。徐曉燕等[23]發(fā)現(xiàn)，ABA可促使煙草煙堿的形成與積累。本研究發(fā)現(xiàn),NtMYC2的啟動子區(qū)域含有ABA響應(yīng)元件ABRE，并且發(fā)現(xiàn)隨著ABA激素處理時間的延長，NtMYC2的相對表達量呈逐漸上升的趨勢，在48 h時到達最高，為對照的17.31倍，說明NtMYC2可能參與ABA脅迫響應(yīng)途徑。因此推測，在一定的時間內(nèi)MeJA與ABA可誘導NtMYC2上調(diào)表達。

高鹽抑制煙草生長發(fā)育，從而影響產(chǎn)量及品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，MYC2的表達能提高小麥耐鹽能力[24]。本研究中，隨著鹽脅迫處理時間的延長，NtMYC2的相對表達量除前6 h外，其余變化并不明顯；由此推測，較長時間的高鹽對NtMYC2的表達影響不大。汪耀富[25]研究表明，干旱脅迫會導致烤煙的產(chǎn)量降低，干旱程度越重對煙葉產(chǎn)量及品質(zhì)的影響越顯著。HIR等[26]發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會抑制擬南芥AtMYC2的表達。但本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫處理時間的延長，在短時間內(nèi)對NtMYC2的表達影響不大，在脅迫48 h后NtMYC2的相對表達量迅速上升，為對照的2.79倍。并且，還發(fā)現(xiàn)NtMYC2的啟動子區(qū)域含有干旱脅迫響應(yīng)元件MBS和CCAAT-Box。因此，說明較長時間的干旱可誘導NtMYC2的表達。低溫脅迫可誘導植物活性氧的積累，破壞細胞內(nèi)DNA和RNA等化合物結(jié)構(gòu)，從而造成蛋白質(zhì)氧化和膜脂過氧化，最終導致細胞死亡[27]。有研究表明，低溫脅迫促進煙草苗期多酚代謝中木質(zhì)素的合成，以增強細胞壁的保護作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，NtMYC2的啟動子區(qū)域有低溫響應(yīng)元件LTR；且NtMYC2的相對表達量隨低溫脅迫時間的延長呈先上升后下降趨勢，在1 ～ 24 h表現(xiàn)為上調(diào)響應(yīng)，在48 h時NtMYC2表現(xiàn)為下調(diào)。說明較長時間的低溫脅迫可能會降低NtMYC2的表達。光照在植物的生長發(fā)育中起著重要的作用，是光合作用所必需的；黑暗條件會加快植物的衰老速度[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在黑暗處理1 h時，NtMYC2的表達與對照無顯著關(guān)系，但在1 h之后均為上調(diào)，并在黑暗處理48 h時NtMYC2的相對表達量達到最高，為對照的8.35倍，說明黑暗可誘導煙草NtMYC2表達。啟動子分析還發(fā)現(xiàn),NtMYC2的啟動子區(qū)域有防御和應(yīng)激元件，說明NtMYC2可能響應(yīng)逆境脅迫應(yīng)答。

MeJA、ABA、高鹽、干旱、低溫和黑暗脅迫能誘導煙草NtMYC2的表達，但不同的激素和逆境應(yīng)答過程中的響應(yīng)所具有的調(diào)控模式有所不同。NtMYC2的表達量在鹽脅迫和干旱脅迫3 h后與MeJA處理3 h后的變化趨勢相似，說明NtMYC2可能通過JA信號網(wǎng)絡(luò)途徑參與鹽脅迫和干旱脅迫響應(yīng)。NtMYC2的表達量在黑暗處理3 h后與ABA處理3 h后的變化趨勢基本相似，說明NtMYC2可能通過ABA信號網(wǎng)絡(luò)途徑參與黑暗脅迫響應(yīng)。因此，NtMYC2可能通過JA或ABA信號網(wǎng)絡(luò)途徑參與逆境脅迫反應(yīng)。