李新建，薛亞輝，王明宇，段棟棟，劉賢，喬瑞敏，韓雪蕾，王克君，李秀領(lǐng)

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省畜牧總站，河南 鄭州 450002)

哺乳動物線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)是目前已知的唯一核外遺傳物質(zhì)，具有相對分子質(zhì)量小、進(jìn)化速度快、結(jié)構(gòu)簡單、呈母系遺傳等特點。其中，D-loop區(qū)是線粒體DNA的非編碼區(qū)，也稱控制區(qū)，負(fù)責(zé)調(diào)控線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，是線粒體DNA中序列和長度變異程度最高的地區(qū)，進(jìn)化速度較其他區(qū)域高5～10倍，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于哺乳動物群體遺傳多樣性、物種親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)生等方面的研究。王繼英等[1]研究了山東各豬種的線粒體DNA D-loop區(qū)，發(fā)現(xiàn)山東地方黑豬血統(tǒng)單一、遺傳關(guān)系較復(fù)雜。李正杰等[2]研究了藏豬的線粒體DNA D-loop區(qū)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)諾爾蓋地區(qū)藏豬遺傳多樣性較高、受人工選擇強度低。趙忠海等[3]對貴州地方豬種的線粒體DNA D-loop區(qū)分析后發(fā)現(xiàn)宗地花豬的遺傳多樣性最為豐富。南陽黑豬、確山黑豬、淮南豬、豫西黑豬是河南省優(yōu)良地方豬品種，具有繁殖力強、肉品質(zhì)高、適應(yīng)性強等特點[4]。20世紀(jì)80年代以來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，消費者對高瘦肉率豬肉的需求不斷提升，致使中國引進(jìn)了生長迅速、瘦肉率較高的西方豬種，這直接導(dǎo)致了河南地方豬數(shù)量的急劇下降，使許多優(yōu)秀基因在尚未研究其價值之前從豬基因庫消失。因此，研究河南省地方豬種的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系，對于正確認(rèn)識和評價地方豬種質(zhì)資源及科學(xué)合理地利用地方豬資源具有重要意義。但目前對河南地方豬種的研究報道還較少。本研究測定分析了河南各地方豬種mtDNA D-loop區(qū)序列，并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列，在分子水平探討了其遺傳資源多樣性及進(jìn)化關(guān)系，為地方豬種的保種和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及保存

河南及鄰省6個豬種(南陽黑豬、確山黑豬、豫西黑豬、淮南豬、萊蕪豬、二花臉豬)和野豬的樣品采集信息見表1。采集到的耳組織樣品，置于1 mL 75%乙醇中保存。3個國外豬種(杜洛克豬、約克夏豬、長白豬)的mtDNA D-loop序列從GenBank下載，序列號為杜洛克豬：AM040623-AM04632、EU660148-EU660151、GQ141897、KF767444，約克夏豬：AM040633-AM040638、GQ141893、GQ169777，長白豬：AM040613-AM040622、GQ141895、GQ169780，共計38條序列。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.2 基因組DNA的提取及檢測

采用組織基因組DNA提取試劑盒(DP304，天根生化科技有限公司)提取DNA。利用微量核酸定量儀(Nanodrop2000)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質(zhì)量。

1.3 PCR擴增及測序

利用Primer5.0根據(jù)NCBI上長白豬參考序列(NC_000845)設(shè)計引物，上游引物為：5′-AGGAGACTAACTCCGCCAT-3′，下游引物為：5′-CGCGGATACTTGCATGTGT-3′，引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25μL):包括40 ngDNA、12.5 μL 2×ES Taq MasterMix(康為世紀(jì)CW2214M)、10 pmol正反向引物、8.5 μL水。擴增條件為:預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30s；退火51.3℃，30 s；延伸72℃，50 s，25個循環(huán)，最后延伸72℃,10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，檢測合格后進(jìn)行Sanger雙向測序。

1.4 序列比對及數(shù)據(jù)分析

利用Mega7.0軟件進(jìn)行序列的核對編輯和拼接及統(tǒng)計各序列堿基的組成，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ法)，Kimura 2-parameter模型，重復(fù)抽樣1000次構(gòu)建單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。使用DNAsp6.12軟件統(tǒng)計單倍型數(shù)量、單倍型多樣度、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異數(shù)，計算歧點分布。使用Popart1.7軟件繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA D-loop區(qū)序列分析

用DNAsp 6.12軟件統(tǒng)計所測豬種的D-loop區(qū)序列的堿基組成，結(jié)果見表2。由表2可知，T、C、A、G四種堿基的平均比例分別為24.92%、26.42%、32.57%、16.03%。A+T的含量為57.49%，大于G+C的含量42.45%，說明所測豬D-loop區(qū)為A-T富集區(qū)。在本研究中，河南4個豬種mtDNA D-loop中串聯(lián)重復(fù)單位均為GCGTACACGT，在不同個體中串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的不同是造成D-loop序列長度差異的主要原因。

2.2 mtDNA遺傳多樣度分析

用DNAsp 6.0軟件統(tǒng)計所測豬種的D-loop區(qū)序列的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果見表3。由表3可知，所測得河南3個豬群體(南陽黑豬、確山黑豬、豫西黑豬)的單倍型多樣度(Hd)均大于0.7，核苷酸多樣度(Pi)均大于0.003，平均核苷酸差異數(shù)(K)均大于2.5，而淮南豬的單倍型多樣度、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異數(shù)分別只有0.788、0.001 56、1.818，相對較低，表明淮南豬群體遺傳差異相對貧乏。萊蕪豬與二花臉豬的群體遺傳變異較豐富。對6個群體的mtDNA D-loop區(qū)序列用Tajima’s D值進(jìn)行中性檢驗，經(jīng)檢驗均不顯著(P>0.05)，符合中性突變。

表2 不同豬種mtDNA D-loop序列堿基組成Table 2 Base composition of mtDNA D-loop sequences in different pig breeds

2.3 mtDNA D-loop區(qū)序列變異分析

將本研究測定的豫西黑豬、南陽黑豬、確山黑豬、萊蕪豬、淮南豬、二花臉豬、野豬282條序列，結(jié)合從GenBank下載的3個國外豬種38條序列共計320條序列進(jìn)行了比對，共發(fā)現(xiàn)37個多態(tài)位點。以單倍型H1為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了比較分析，界定了42種單倍型，群體間共享單倍型15個、某個群體所獨有單倍型27個(南陽黑豬5個、豫西黑豬10個、確山黑豬4個、淮南豬2個、萊蕪豬3個、二花臉豬1個、野豬2個)，各單倍型變異位點見表4。

表3 不同豬種mtDNA D-loop序列多態(tài)性、單倍型及其多樣性Table 3 The polymorphism,haplotypes and genetic diversity of mtDNA D-loop sequence in different pig breeds

2.4 mtDNA D-loop系統(tǒng)發(fā)育分析

以非洲疣豬的mtDNA D-loop序列(GenBank登錄號：DQ409321)作為外群構(gòu)建河南4個地方豬種以及萊蕪豬、二花臉豬和3個國外豬種的mtDNA D-loop序列單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由圖1可知，用于分析的42個單倍型在NJ樹上明顯分為2個獨立的支系。一支包含了所有地方豬和部分大約克夏豬，另一支則全部是3個國外豬種的單倍型，表明河南4個地方豬種間的親緣關(guān)系較近，而與國外豬種間親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn)，河南4個地方豬種與3個國外豬種有著兩個明顯不同的起源。豫西黑豬、南陽黑豬、確山黑豬、淮南豬、萊蕪豬及二花臉豬的單倍型在整個系統(tǒng)進(jìn)化樹中分布較為緊密，且具有多個共享單倍型，表明這幾個群體彼此之間可能有基因交流。國外豬種大約克夏豬有一個單倍型與地方豬聚在一起，表明大約克夏豬的母源血統(tǒng)部分來自于中國地方豬種。再結(jié)合已登錄GenBank的中國其他地方豬16條序列，重新繪制單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與圖1類似，進(jìn)化樹主干明顯分為2個支系。

2.5 單倍型網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)DNAsp6.12軟件統(tǒng)計分析并輸出的單倍型結(jié)果，利用Popart1.7軟件構(gòu)建了河南和鄰省6種地方豬mtDNA D-loop單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果也明顯分為2支(圖3)。每個圓代表1種單倍型，圓的面積大小表明其頻率的高低，圓中不同的顏色代表不同類型豬種。由圖3可知，單倍型H12、H13、H18中的豬品種數(shù)較多，呈發(fā)散狀，表明群體可能發(fā)生過群體擴張。單倍型H9、H12、H13、H17、H18、H20、H21、H23、H28為不同品種間共享單倍型。

2.6 種群歷史動態(tài)分析

使用DNAsp6.12的Population size down模型對河南4個地方品種單倍型進(jìn)行歧點分布分析，結(jié)果如圖4。由圖4可知，歧點分布實際值呈多峰分布，與假定期望模型不符，且中性檢驗值Tajima’s D為-1.877 21，F(xiàn)u’s Fs為-26.018，經(jīng)檢驗差異顯著(P<0.05),表明河南地方豬群體曾經(jīng)歷過群體擴張事件。結(jié)合表3可知，各群體內(nèi)Tajima’s D檢驗不顯著，河南地方豬累加的突變使中性檢驗結(jié)果顯著。

3 討論與結(jié)論

3.1 mtDNA D-loop遺傳多樣性分析

衡量一個品種(群體)mt DNA變異程度的兩個重要指標(biāo)是單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)，單倍型多樣度是指樣本中隨機抽取到2個不同單倍型的頻率、核苷酸多樣度是指給定群體內(nèi)隨機選取的mtDNA 序列間的平均每個位點的核苷酸差異數(shù)目[5]。Hd和Pi值越大，群體的多態(tài)程度越高，其遺傳多樣性越豐富[6]。據(jù)統(tǒng)計同種動物的個體之間的平均核苷酸順序奇異值在0.3%～4.0%，有時甚至可達(dá)10%[7]。

本研究的河南4個地方豬群體中單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.788～0.854、0.001 56～0.004 55，4個豬種的Hd值分別高于萊蕪豬(0.589)、陸川豬(0.640)、東鄉(xiāng)花豬(0.768)、藏豬(0.705)、滇南小耳豬(0.759)，低于二花臉豬(0.947)、桂中花豬(0.942)、合作豬(0.883)，與保山豬(0.828)、五指山豬(0.838)、巴馬香豬(0.875)處于同等水平；但4個豬種中除淮南豬核苷酸多樣度(Pi)值較低，為0.001 56，其余3個豬種Pi值分別高于萊蕪豬(0.002 46)、藏豬(0.002 83)、低于東鄉(xiāng)花豬(0.005 9)、陸川豬(0.007 4)、滇南小耳豬(0.005 21)、合作豬(0.005 49)、與二花臉豬(0.003 73)、桂中花豬(0.003 43)、巴馬香豬(0.003 37)、保山豬(0.003 71)、五指山豬(0.003 34)、巴馬香豬(0.003 37)處于同等水平，表明河南地方豬種遺傳多樣性相對豐富[8-12]。

從河南地方豬種單倍型分布來看，4個群體的共享單倍型H12、H13、H18頻率分別為45、41、47，說明這3種單倍型應(yīng)該是河南地方豬共同的祖先單倍型。結(jié)合單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析顯示河南地方豬種至少存在3個不同母系馴化事件[13]。

3.2 群體系統(tǒng)發(fā)育分析

張冬杰等[14]對中國43個地方豬品種和3個國外豬種基于mtDNA D-loop序列NJ分子進(jìn)化樹顯示，中國地方豬和國外品種處在2個不同分支上。黃樹文等[15]構(gòu)建了基于遺傳距離的廣東5個地方豬種和國外4個豬種NJ進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)廣東省地方豬與西方豬種遺傳距離較遠(yuǎn)。本研究結(jié)果表明，用于分析的7個群體在NJ樹上明顯聚為2個獨立支系：一支包含了所有河南及鄰省地方豬群體、野豬群體和部分大約克夏豬的單倍型，另一支則全部是3個國外豬種的單倍型。這與以上研究結(jié)果基本一致，同時也支持多數(shù)學(xué)者認(rèn)同的現(xiàn)代家豬起源于歐亞兩大母系的二元論觀點[16-18]。然而,LARSON等[19]通過分析全世界范圍內(nèi)686個家豬和野豬個體mtDNA D-loop序列后認(rèn)為家豬的起源在歐亞大陸有多個獨立的馴化中心。LUETKEMEIER等[20]通過亞歐家豬和野豬mt DNA基因組分析得出中國豬有多個馴化中心。王志等[21]通過對黃河流域古代豬mtDNA D-loop序列的分析發(fā)現(xiàn)，黃河流域曾是中國家豬馴化中心之一。但YU等[22]在利用mtDNA D-loop區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中國地方豬起源時，發(fā)現(xiàn)中國家豬可能起源于長江流域和華南地區(qū)的野豬。河南地方豬具體起源何處，需要進(jìn)一步的研究與證實。

本研究發(fā)現(xiàn)，約克夏豬部分單倍型與河南地方豬聚為一類，這與張冬杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)約克夏豬部分單倍型與梅山豬聚為一類，張冰等[23]研究發(fā)現(xiàn)約克夏豬部分單倍型與廣西地方豬聚為一類，NI等[18]研究發(fā)現(xiàn)約克夏豬和中國地方豬聚為一類，而非歐洲豬。許多研究[14,18,23]結(jié)果都表明約克夏豬部分母源血統(tǒng)來自中國地方豬，據(jù)此推測在約克夏豬培育過程中，可能引入了中國豬種的血統(tǒng)。

綜上所述，河南省地方豬4個品種共236條序列，定義了32種單倍型，單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.788～0.854、0.001 56～0.004 55，表明遺傳多樣性較豐富。河南地方豬與西方豬種遺傳差異較大，與西方商業(yè)豬種明顯聚為2個獨立分支，表明mtDNA D-loop序列可作為研究種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育、起源進(jìn)化的分子標(biāo)記。歧點分布顯示，整個河南地方豬群體曾經(jīng)歷過群體擴張事件。