傅增輝 金 艷 林再紅 姜 巖 劉 晶 杜 姝 張廣萍 陳團(tuán)團(tuán)

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，齊齊哈爾 161002）

抑郁癥（depression）是一種復(fù)雜的情感性精神障礙綜合征，其發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。白樺脂醇（Betula platyphylla），又稱樺木醇、樺木腦，為白樺樹皮提取物[2]。近年研究表明白樺脂醇與白樺脂酸具有抗炎、抗菌和抗病毒等作用，并表現(xiàn)出巨大的藥理學(xué)潛能。動物實(shí)驗(yàn)提示其具有生物活性多樣，且在較高劑量下毒性很低[3]。有研究報(bào)道，白樺脂醇在Aβ 誘導(dǎo)的癡呆大鼠模型上顯示出顯著改善認(rèn)知功能的作用[4]，并且在腦缺血再灌注模型上表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用[5]。研究證實(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的多種神經(jīng)遞質(zhì)與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[6]；另外，傅曉艷等[7]報(bào)道，神經(jīng)營養(yǎng)因子對抑郁癥的抑郁行為具有神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)將探討白樺脂醇對慢性應(yīng)激抑郁模型即慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠的抗抑郁作用，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的抑郁行為，檢測海馬神經(jīng)元凋亡情況，檢測5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和多巴胺（dopamine，DA）神經(jīng)遞質(zhì)水平，檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3（neurotrophin-3，NT-3）和神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）水平，為治療抑郁癥提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，也為抑郁癥治療靶點(diǎn)的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠40只，2月齡，體質(zhì)量（194.01±18.03）g，均由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：第SCXK（黑）2016-001 號，本實(shí)驗(yàn)遵循齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)動物使用管理規(guī)定，并通過齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。飼養(yǎng)溫度（25±1）℃，濕度50%～55%，24 h 晝夜循環(huán)光環(huán)境，及時(shí)更換墊料并提供充足的食物和水。

1.2 試劑

白樺脂醇由大興安嶺林格貝寒帶生物產(chǎn)業(yè)公司提供；放射免疫分析藥盒為北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司產(chǎn)品；兔抗鼠多克隆抗體，美國Abbkine公司提供；Revert Aid First Strand cDNA synthesis、SYBR Premix Ex TaqTM、ROXReference Dye Ⅱ，美國Thermo Fisher 公司提供。

1.3 動物分組及造模

將40 只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、氟西汀組和白樺脂醇組，每組10 只。正常組大鼠常規(guī)群養(yǎng)結(jié)合蒸餾水灌胃每日1 次；模型組大鼠孤養(yǎng)CUMS 結(jié)合蒸餾水灌胃每日1 次；氟西汀組大鼠每日應(yīng)激刺激前1 h 給予氟西汀灌胃（用蒸餾水配置，給藥5 mg·mL-1·kg-1）；白樺脂醇組大鼠每日應(yīng)激刺激前1 h 給予白樺脂醇灌胃（用蒸餾水配置，給藥20 mg·mL-1·kg-1），4 組均持續(xù)28 d 后進(jìn)行行為學(xué)檢測。采用改進(jìn)CUMS 抑郁動物模型[8]造模方法。正常組每籠飼養(yǎng)5 只，正常飲食、飲水，不予任何刺激；接受造模組每籠飼養(yǎng)1 只，應(yīng)激刺激持續(xù)28 d，包括：禁水24 h、禁食24 h、夾尾 1 min、電擊足底20 V，每次10 s每次電擊間隔 1 min，20次、強(qiáng)迫冰水游泳4℃4 min、傾斜籠子45°12 h、轉(zhuǎn)換晝夜節(jié)律、制動2 h、熱刺激40℃ 5 min。每天隨機(jī)安排1種刺激，相同刺激不連續(xù)出現(xiàn)，每種刺激重復(fù)不少于4次。造模結(jié)束根據(jù)體重及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行模型評價(jià)。

1.4 行為學(xué)檢測

（1）懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST），將大鼠尾巴連接于高處，距離地面1.5 m 左右，記錄并計(jì)算每只大鼠在5 min 內(nèi)靜止的時(shí)間。其中靜止時(shí)間為大鼠頭部和肢體相對于軀干不動而軀干擺動的時(shí)間。（2）糖水偏愛測試（sucrose preference test，SPT），每籠均放置2 個水瓶，第1個24 h，2瓶均為1%蔗糖水，隨后的24 h，一瓶為1%蔗糖水，另一瓶為蒸餾水，禁食水24 h 后，進(jìn)行動物的糖水消耗實(shí)驗(yàn)，即同時(shí)給予每只大鼠預(yù)先定量好的1%蔗糖水、蒸餾水各1 瓶，24 h 后計(jì)算糖水進(jìn)食量，并統(tǒng)計(jì)大鼠的糖水偏愛率，糖水偏愛率（%）＝糖水進(jìn)食量/總液體消耗×100%。（3）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）將大鼠單獨(dú)放入透明水缸中，水溫23℃～25℃。游泳進(jìn)行6 min，前2 min 不做記錄，觀察記錄鼠的不擺動時(shí)間，即后4 min 漂浮不動時(shí)間。為避免對下一只測試鼠產(chǎn)生影響，每次實(shí)驗(yàn)后消毒水缸并更換水。

1.5 檢測凋亡細(xì)胞

大鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，每組中隨機(jī)取5 只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，剪開腹壁，暴露心，用灌注穿刺針沿著心的縱軸方向經(jīng)心尖部插入左心室至主動脈根部，止血鉗固定，剪開右心耳，立即灌入4℃的生理鹽水，多聚甲醛灌注，后取出腦組織，多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋，切片。按羅氏TUNEL 凋亡染色試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL 細(xì)胞凋亡染色，細(xì)胞核呈棕黃色染色為陽性細(xì)胞。每只大鼠取5 張腦染色切片，每張切片隨機(jī)觀察并拍攝5 個非重疊高倍（10 目鏡×40 物鏡）視野，將所拍圖片用美國IPP6.0 圖像處理，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)目，用凋亡細(xì)胞數(shù)/高倍鏡視野表示。

1.6 檢測5-HT、NE 和DA 神經(jīng)遞質(zhì)水平

采用高效液相-電化學(xué)檢測（HPLC-ECD）測定各組大鼠腦內(nèi)5-HT、NE 和DA 含量，取每組剩余的5 只，將大鼠行斷頭，快速在冰盤上分離出腦組織，制作組織勻漿，4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，取上清，用高效液相-電化學(xué)檢測（HPLCECD）法檢測腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE 和DA 的色譜，進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算出各組大鼠腦中5-HT、NE 和DA 的含量。

1.7 免疫印跡檢測BDNF、NT-3 和NGF 蛋白水平

BDNF、NT-3 和NGF 水平的檢測采用免疫印跡，取1.6 步驟中組織勻漿并提取總蛋白，用12%的膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（均為1∶ 1 000）4 ℃緩慢孵育過夜，含2.5%脫脂奶粉的TBST 洗膜2 次，每次5 min。山羊抗兔二抗（1∶ 5 000）室溫孵育1 h，清洗同上。ECL 顯色，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析檢測結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化

與正常組比較，大鼠造模在第2周即出現(xiàn)體質(zhì)量下降（P＜0.01），反映大鼠在抑郁形成的過程中導(dǎo)致體質(zhì)量減輕，說明造模成功；與模型組比較，氟西汀組和白樺脂醇組大鼠的體質(zhì)量在3、4周增加（P＜0.05或P＜0.01），且在4周時(shí)白樺脂醇組較氟西汀組的大鼠體質(zhì)量改善明顯（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠不同時(shí)間體質(zhì)量的比較（n=10，±s，g）Tab1 Comparison of body mass change of rats（n=10，±s，g）

表1 各組大鼠不同時(shí)間體質(zhì)量的比較（n=10，±s，g）Tab1 Comparison of body mass change of rats（n=10，±s，g）

**P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs fluoxetine group

Group 1 week 2 weeks 3 weeks 4 weeks Normal group 194.74±18.87 241.44±16.44 276.73±19.65 293.84±21.83 Model group 193.30±16.90 153.85±20.75** 125.75±16.37** 108.48±17.01**Fluoxetine group 195.69±17.74 157.10±17.96 173.84±18.67△ 181.96±18.75△△Betula platyphylla group 194.83±18.94 159.22±19.41 181.63±15.12△△ 204.18±21.81△△#

2.2 各組大鼠行為學(xué)比較

造模成功后，抑郁模型大鼠表現(xiàn)出行動遲緩，精神萎靡，治療后，氟西汀組和白樺脂醇組較治療前改善，模型組無變化。治療后，與正常組比較，模型組大鼠懸尾靜止時(shí)間、強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間均明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組和白樺脂醇組均明顯延長（P＜0.01），且氟西汀組較白樺脂醇組明顯延長（P＜0.05）。與正常組比較，模型組大鼠糖水偏愛率明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組和白樺脂醇組均明顯下降（P＜0.01），且氟西汀組較白樺脂醇組明顯下降（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠行為學(xué)比較（n=10，±s）Tab2 Comparison of rat behavior in each group（n=10，±s）

表2 各組大鼠行為學(xué)比較（n=10，±s）Tab2 Comparison of rat behavior in each group（n=10，±s）

**P＜0.01 vs normal group；△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs fluoxetine group

Group Suspension time（s）Scurose preference test（%）Forced swimming time（s）Normal group 45.74±5.63 11.73±2.09 82.20±6.43 Model group 95.33±4.01** 5.91±1.93** 152.89±10.01**Fluoxetine group 68.05±6.71△△ 8.62±1.57△△ 113.22±7.40△△Betula platyphylla group 55.83±7.82△△# 10.19±2.15△△# 91.04±8.95△△#

2.3 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)比較

經(jīng)TUNEL染色后，各組均可見TUNEL陽性細(xì)胞，凋亡細(xì)胞被染成棕色，細(xì)胞核呈棕黃色，有些細(xì)胞核則固縮深染，呈深棕色，形狀不規(guī)則，有的呈指環(huán)樣，有的在其核周可見棕黃色毛刷樣結(jié)構(gòu)，部分凋亡陽性細(xì)胞胞質(zhì)亦著色。與正常組（0.210%±0.034%）海馬凋亡細(xì)胞數(shù)/高倍鏡視野比較，模型組（0.974%±0.047%）顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組（0.497%±0.028%）和白樺脂醇組（0.331%±0.040%）顯著下降（P＜0.01）；且白樺脂醇組顯著低于氟西汀組（P＜0.05，圖2）。

2.4 各組大鼠5-HT、NE 和DA 含量比較

與正常組大鼠腦組織中5-HT、NE 和DA 含量比較，模型組均明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組和白樺脂醇組均明顯減少（P＜0.01），且氟西汀組較白樺脂醇組明顯減少（P＜0.05，表3）。

2.5 各組大鼠BDNF、NT-3 和NGF 蛋白表達(dá)水平比較

與正常組大鼠腦組織BDNF、NT-3 和NGF蛋白相對表達(dá)水平比較，模型組均明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組和白樺脂醇組均明顯增加（P＜0.01）；氟西汀組較白樺脂醇組明顯減少（P＜0.05，圖2）。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡比較，TUNEL 染色，×400Fig1 Comparison of neuron apoptosis in the hippocampus of rats in each group，TUNEL staining，×400

表3 各組大鼠5-HT、NE 和DA 含量比較（n=10，±s，μg/mL）Tab3 Comparison of 5-HT，NE and DA content in rats of each group（n=10，±s，μg/mL）

表3 各組大鼠5-HT、NE 和DA 含量比較（n=10，±s，μg/mL）Tab3 Comparison of 5-HT，NE and DA content in rats of each group（n=10，±s，μg/mL）

**P＜0.01 vs normal group；△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs fluoxetine group

Group 5-HT NE DA Normal group 0.27±0.04 0.89±0.03 0.39±0.05 Model group 0.08±0.03** 0.40±0.05** 0.18±0.08**Fluoxetine group 0.19±0.02△△ 0.68±0.04△△ 0.28±0.03△△Betula platyphylla group 0.26±0.03△△# 0.83±0.03△△# 0.35±0.06△△#

圖2 各組大鼠BDNF、NT-3 和NGF 蛋白表達(dá)水平比較Fig2 Expression of BDNF，NT-3 and NGF protein in rats of each group

3 討論

為探討白樺脂醇的抗抑郁作用，本研究選取慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠為研究對象，觀察其在行為學(xué)中的變化，檢測大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究白樺脂醇提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)CUMS 成功建立模型，運(yùn)用慢性、低水平的應(yīng)激源導(dǎo)致抑郁狀態(tài)[9]，這與人類發(fā)生抑郁的機(jī)制更為接近，且CUMS 模型模擬快感缺乏等抑郁癥狀表現(xiàn)可持續(xù)幾個月，基本符合抑郁模型的要求。

大多數(shù)國家和地區(qū)抑郁癥的發(fā)病率在8%～12%，25～40 歲一般為首次發(fā)病年齡，第2個發(fā)病高峰為50～60 歲[10]。近年來“單胺假說”的發(fā)病機(jī)制中神經(jīng)遞質(zhì)及其受體備受學(xué)界關(guān)注[11]，有學(xué)者報(bào)道，抑郁焦慮癥狀在通過藥物影響腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能和提升其在神經(jīng)突觸間的濃度中精神活動、情緒反應(yīng)、體溫調(diào)節(jié)和學(xué)習(xí)記憶等功能改善[12]。5-HT、NE 和DA 均為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[13]，這些重要的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種生理功能和病理狀態(tài)的調(diào)控，并且伴有心境低落、食欲減退、睡眠障礙、晝夜節(jié)律紊亂、性功能障礙和運(yùn)動功能抑制等癥狀的抑郁癥患者，往往伴有5-HT、NE 和DA 水平功能的下降[14]。在本研究中，白樺脂醇治療可以提高CUMS 大鼠腦內(nèi)5-HT、NE 和DA 水平，且與氟西汀組相比其水平更高。

神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophin）家族是一類小分子多肽物質(zhì)，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，維持神經(jīng)系統(tǒng)的功能，在各種神經(jīng)的生長發(fā)育以及再生中起重要作用[15]。神經(jīng)營養(yǎng)因子具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化發(fā)育并促進(jìn)神經(jīng)存活、分裂及生長等作用，對抑郁癥的抑郁焦慮情緒、認(rèn)知功能有顯著的調(diào)節(jié)作用，其家族成員包括BDNF、NT-3 和NGF 等[16]。研究表明，抑郁癥模型大鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡及失活伴隨著BDNF、NT-3 和NGF 的表達(dá)降低，而上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中BDNF、NT-3 和NGF 的水平可以調(diào)節(jié)抑郁行為[17]。Bermingham 等[18]證實(shí)，中樞神經(jīng)中神經(jīng)元內(nèi)的BDNF 表達(dá)可通過調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，結(jié)合單胺受體而發(fā)揮其生物學(xué)作用。并且BDNF 具有調(diào)節(jié)和保護(hù)5-HT 能神經(jīng)元和DA 能神經(jīng)元的作用，是兩者神經(jīng)元的重要調(diào)控物質(zhì)[19]。上調(diào)抑郁模型大鼠海馬區(qū)BDNF 的表達(dá)以促進(jìn)5-HT 與NE 的水平，能夠緩解大鼠的抑郁焦慮情緒[20]。Duman 等[21]在 2006年提出“抑郁癥的神經(jīng)營養(yǎng)假說”。BDNF對神經(jīng)纖維重塑、神經(jīng)元再生與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展有深遠(yuǎn)影響和作用，慢性應(yīng)激能引起B(yǎng)DNF 水平降低，神經(jīng)元凋亡數(shù)量增加，而BDNF 的表達(dá)下調(diào)可以增高抑郁焦慮情緒發(fā)生，且經(jīng)抗抑郁藥物治療后，CUMS 模型大鼠海馬區(qū)BDNF 表達(dá)明顯升高[22]。在本研究中，白樺脂醇治療可以提高CUMS 大鼠腦組織BDNF、NT-3 和NGF 水平，且與氟西汀組相比其水平更高，正如既往研究，白樺脂醇可能通過干預(yù)神經(jīng)營養(yǎng)因子水平而影響神經(jīng)遞質(zhì)水平并改善CUMS 大鼠抑郁水平。

本實(shí)驗(yàn)采用多種行為學(xué)檢測，證實(shí)白樺脂醇可以緩解CUMS 模型大鼠抑郁行為，推測其是通過影響神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT-3 和NGF 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平，從而發(fā)揮其抗抑郁的功效。課題組將繼續(xù)從區(qū)域定位角度研究白樺脂醇對神經(jīng)元再生的影響，深入闡明其對神經(jīng)結(jié)構(gòu)功能影響的分子機(jī)制及作用靶點(diǎn)。