戴研平 高曉勤

（1 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，貴陽 550004；2 遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遵義 563006；3 岳陽市岳陽樓區(qū)人民醫(yī)院，岳陽 414000）

砷能夠?qū)ι诚到y(tǒng)造成損害。據(jù)統(tǒng)計中國已有超過300 萬的高砷暴露人群[1-2]。長期飲高砷水能夠損害真核細(xì)胞的染色體，并對其子代產(chǎn)生影響[3]。目前關(guān)于砷中毒的機制研究還不明確[4]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體2（vascular endothelial growth factor recepector 2，VEGFR2）在睪丸組織中有表達，且可能與雄性生殖有關(guān)[5-7]。VEGF 能夠促進血管生成，VEGFR2 即KDR 是血管發(fā)生和構(gòu)建的主要調(diào)節(jié)者。VEGF/VEGFR-2（KDR）結(jié)合后會抗凋亡、促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖、提高血管通透性等[8-10]。已經(jīng)明確長期砷暴露可影響人類的生殖和發(fā)育，但關(guān)于其生殖毒性具體機制還不明確[11-13]。本研究旨在通過血管生成的角度探討慢性砷中毒對大鼠睪丸損傷的分子機制，為砷中毒引起男性不育的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物分組及模型建立

健康清潔級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量160～200 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠隨機分為高、中、低劑量砷酸毒組和對照組，每組10 只。用亞砷酸鈉配制的水溶液進行染毒，高、中、低劑量砷酸毒組染毒劑量分別為：60、12、2.4 mg/L，對照組飲用蒸餾水，采用自由飲用方式進行連續(xù)染毒6月，建立慢性砷中毒大鼠的動物模型。

1.2 主要試劑

亞砷酸鈉（分析純，北京化工廠）；VEGF 和VEGFR2 兔抗鼠多克隆抗體（GeneTex 公司）；山羊抗兔IgG（北京中杉金橋有限公司）；TRIzol 提取試劑盒（Thermo Scientific 公司）；流式細(xì)胞試劑盒（BD 公司）。

1.3 H-E 染色觀察各組大鼠睪丸組織一般結(jié)構(gòu)的變化

每組隨機選取3 只大鼠左側(cè)睪丸制作石蠟切片，每組隨機抽3 張切片，主要步驟如下：（1）切片常規(guī)脫蠟至水；（2）蘇木精室溫下染色約15 min，自來水沖洗；（3）酸乙醇脫色，氨乙醇藍化；（4）室溫下染伊紅2～3 min；（5）上行脫水、透明；（6）中性樹膠封片。

1.4 免疫熒光化學(xué)法對VEGF 和VEGFR2 的表達進行定位

每組隨機選取3 只大鼠左側(cè)睪丸組織石蠟切片化蠟下行至水,30 ml/L 過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，山羊抗血清室溫下封閉30 min，4 ℃孵育一抗（1∶100）過夜，次日在恢復(fù)室溫下復(fù)溫40 min后用FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶500）在37 ℃孵育2 h，采用甘油-碳酸氫鈉濕封劑封片。上述步驟均 在0.01 mmol/L PH（7.0～7.4）/L PBS 洗3 次，每次5 min。用熒光顯微鏡（OlympusBX51）拍照。

1.5 實時熒光定量PCR 法檢測VEGF 和VEGFR2 的mRNA 表達水平

每組隨機選取3 只大鼠右側(cè)睪丸，抽取右側(cè)睪丸總RNA 并測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在實時熒光定量PCR 中作為模板（表1）。采用SYBR Green I 熒光染料法在ABI 7900 定量PCR 儀器上進行。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性l0 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，40 個循環(huán)，GAPDH 為內(nèi)參，檢測各模板的Ct 值（C 代表cycle，T 代表threshold）。

表1 GAPDH、VEGF、VEGFR2 PCR 引物序列Tab1 PCR primers for GAPDH，VEGF and VEGFR2

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測精子凋亡

每組隨機選取3 只大鼠右側(cè)附睪，分離大鼠右側(cè)附睪尾部，用眼科剪在附睪尾部剪一小口，用2 把眼科鑷交替擠壓，使精子流出，將精液放入預(yù)冷的PBS 液中洗滌離心2 次，每次5 min；重懸細(xì)胞用1×Binding Buffer 稀釋精子濃度至1×106個/mL，用200 目尼龍紗布過濾；取100 μL 懸液于5 mL 的培養(yǎng)管；加入5 μL FIFC 和5 μL PI；輕輕重懸后置于暗盒中15 min；每管再加入400 μL 1×Binding Buffer，在1 h 之內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，用FlowJo 軟件分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

對照組大鼠進食飲水均正常，毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)良好，無異常反應(yīng)；與對照組相比，低劑量砷組體質(zhì)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中、高劑量砷組毛發(fā)粗糙，泛黃，精神萎靡，易激惹，體質(zhì)量增長緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中、高劑量砷組的右側(cè)睪丸質(zhì)量與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量砷組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各組臟器系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

2.2 各組大鼠睪丸組織病理學(xué)變化

光鏡下，對照組睪丸組織生精小管上皮結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列緊密，生精上皮細(xì)胞有5～7 層（圖1A，見封二）。低劑量砷組生精小管上皮結(jié)構(gòu)疏松，只有3～5 層細(xì)胞（圖1B，見封二）。中劑量砷組可見生精小管間隙增寬，上皮結(jié)構(gòu)疏松，排列層次紊亂，有2～4 層細(xì)胞，管腔中可見脫落的生精細(xì)胞（圖1C，見封二）。高劑量砷組生精小管上皮細(xì)胞層次進一步減少，僅剩1～2 層，生精細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣改變。部分管腔中可見大量脫落的生精細(xì)胞（圖1D，見封二）。

表2 各組大鼠體質(zhì)量、右側(cè)睪丸質(zhì)量、臟器系數(shù)檢測結(jié)果（n=10，±s）Tab2 Body weight，right testicular weight and viscera coefficient in each group（n=10，±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量、右側(cè)睪丸質(zhì)量、臟器系數(shù)檢測結(jié)果（n=10，±s）Tab2 Body weight，right testicular weight and viscera coefficient in each group（n=10，±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Body weight（g）Right testicular weight（g）Right viscera coefficient（%）Before infection After infection Control group 198.70±13.22 310.90±18.82 1.7030±0.0838 0.5480±0.0480 Low dose arsenic group 201.30±19.19 298.00±19.80 1.6360±0.0948 0.5500±0.0386 Middle dose arsenic group 196.80±16.53 279.30±24.92*1.5700±0.1065*0.5640±0.0460 High dose arsenic group 194.90±12.47 267.50±25.97*1.5530±0.1111*0.5870±0.0864

2.3 睪丸組織VEGF、VEGFR2 的表達情況

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，VEGF 和VEGFR2在大鼠睪丸中均有表達，VEGF 主要位于睪丸精原細(xì)胞和支持細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核、初級精母細(xì)胞及精子細(xì)胞的頂體和精子殘余體。VEGFR2 位于精子細(xì)胞發(fā)育中的頂體、精原細(xì)胞及支持細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核、間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和部分血管內(nèi)皮及管壁平滑肌（圖2，見封二）。

2.4 各組大鼠睪丸VEGF，VEGFR2 mRNA表達情況

與對照組比較，低、中、高劑量砷組VEGF mRNA（1.17±0.05、0.80±0.03、0.77±0.03比2.84±0.06）、VEGFR2 mRNA（0.92±0.06、0.69±0.04、0.56±0.02 比1.57±0.05）含量均較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠精子凋亡率

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨著染毒劑量的增加，精子早期平均凋亡率逐漸增加。與對照組比較，低、中、高劑量砷組精子平均凋亡率（1.12±0.07、3.80±0.25、9.10±0.12 比0.99±0.08）明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

砷中毒是引起男性不育的重要原因之一，但其具體機制還不清楚。慢性砷中毒可導(dǎo)致睪丸血流動力學(xué)改變，影響睪丸精子發(fā)生和附睪精子的成熟，甚至導(dǎo)致不育[14-15]。

砷可影響睪丸生精細(xì)胞導(dǎo)致精子質(zhì)量下降[16]。生長因子在睪丸生精細(xì)胞的活動中起重要作用[17-18]。研究證明，VEGF與生精功能的調(diào)節(jié)有關(guān)[19]。本研究H-E染色結(jié)果顯示，對照組睪丸組織生精上皮內(nèi)生精細(xì)胞排列緊密，中、高劑量砷組部分生精小管的初級精母細(xì)胞層與精原細(xì)胞層之間發(fā)生分離，生精上皮細(xì)胞層數(shù)減少，排列稀疏，且間質(zhì)不同程度地增寬，腔內(nèi)精子數(shù)減少，這些均為生精障礙的表現(xiàn)。本研究顯示砷中毒前，染毒組與對照組大鼠體質(zhì)量比較無明顯差別。砷染毒后，中、高劑量組大鼠體質(zhì)量下降。隨著染毒劑量的增加，睪丸質(zhì)量逐漸下降，說明砷具有一定的抑制大鼠睪丸生長的作用。但各組右側(cè)睪丸系數(shù)對比無明顯差異，可能是大鼠的體質(zhì)量下降或睪丸組織水腫導(dǎo)致的誤差所致。以上結(jié)果提示，砷可損傷睪丸組織，引起睪丸萎縮，這可能是其導(dǎo)致睪丸質(zhì)量減輕的一個原因。RT-PCR 結(jié)果示，與對照組相比，各染毒組VEGF 及VEGFR2 的表達水平下降，可能是砷損害了大鼠睪丸間質(zhì)的血管通透性，進而影響VEGF 及VEGFR2 的表達所致。

外源性的化學(xué)物質(zhì)可影響生精細(xì)胞的活動，導(dǎo)致精子活力下降[20]。研究表明，砷可通過血睪屏障損害男性生殖細(xì)胞[21]。VEGF 及VEGFR2 對精子頂體的發(fā)育具有重要作用。VEGF 能通過作用于其受體對男性生殖起調(diào)節(jié)作用[22]。精子是VEGF 的靶細(xì)胞之一。頂體位于精子頭部，對男性的生育力有直接影響[23]。睪丸內(nèi)精子發(fā)生受到生物因子的作用[24]。VEGF 是最強的血管通透因子，VEGFR2 是血管形成和生成的主要調(diào)節(jié)者。

本研究免疫熒光結(jié)果顯示，睪丸血管內(nèi)皮及小血管平滑肌上有VEGF 表達，筆者推測VEGF 可能以自分泌或旁分泌方式作用于睪丸間質(zhì)毛細(xì)血管，調(diào)節(jié)睪丸微血管通透性和血管化[25]。VEGF 在支持細(xì)胞也有表達，它可通過旁分泌作用于生精細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果還顯示，VEGFR2 在精子頂體也有表達，與上述研究者的結(jié)果一致[26-27]。

砷中毒可引起凋亡[28-29]。本研究流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組比較，各染毒組大鼠精子凋亡率均升高。其原因可能為砷影響睪丸組織VEGF 及VEGFR2 的表達，這2 種因子共同作用于睪丸的血管系統(tǒng)，影響精子的發(fā)生和成熟。

總之，本研究結(jié)果說明慢性砷中毒時大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)小血管發(fā)生改變，VEGF 和VEGFR2 的表達水平逐漸下降，而精子凋亡率升高。砷可能通過影響VEGF 和VEGFR2 的表達和睪丸間質(zhì)細(xì)胞、血管間接改變精子發(fā)生、發(fā)育，進而共同影響男性生育力，但其具體機制有待進一步研究。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理學(xué)改變，×400。Fig1 Histopathological changes of testis in each group，×400.

圖2 免疫熒光術(shù)檢測大鼠睪丸VEGF，VEGFR2 的表達，標(biāo)尺=100 μm。Fig2 Immunofluorescence technique was used to detect the expression of VEGF and VEGFR2 in rat testis，bar= 100 μm.