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GPER激動劑G-1在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用研究*

2020-07-09 11:55王超君徐勝前葉冠雄潘德標(biāo)葉海林
醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐 2020年13期
關(guān)鍵詞:貨號介素轉(zhuǎn)氨酶

秦 勇 王超君 徐勝前 葉冠雄 潘德標(biāo) 葉海林

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院(麗水市人民醫(yī)院) 1 肝膽外科 2 超聲科,浙江省麗水市 323000

肝臟缺血再灌注損傷在臨床上常見于失血性休克、肝腫瘤切除和肝移植等情況,也是目前肝臟保護(hù)研究的熱點(diǎn),近年來雌激素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的研究發(fā)現(xiàn)雌激素預(yù)處理能刺激雌激素受體表達(dá),進(jìn)而降低TNF-α水平,抑制NF-κB表達(dá)來減輕肝臟缺血再灌注損傷[1],而雌激素受體GPER作為雌激素的獨(dú)立受體,在傳統(tǒng)雌激素受體ERα和ERβ缺乏的細(xì)胞中介導(dǎo)了雌激素對靶細(xì)胞的快速效應(yīng),目前未見有關(guān)GPER激動劑G-1在肝臟缺血再灌注損傷中的相關(guān)作用的報道。本研究建立肝臟缺血再灌注損傷模型觀察GPER激動劑G-1在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料 成年健康雄性SD大鼠54只,體重(250±20)g,由上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司提供。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是由瑞士Roche公司(貨號11684817910)提供,DAB濃縮型試劑盒是由上海長島生物技術(shù)有限公司(貨號FL-6001)提供,G-1是由美國Med Chem Express公司提供(貨號HY-107216),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測試盒是由南京建成生物有限公司提供(貨號C009-1),大鼠白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒由武漢華美生物有限公司提供(貨號GSB-E08055r)。

1.2 動物分組 54只大鼠隨機(jī)分成三組,每組18只。G-1預(yù)處理+肝缺血再灌注組(GIR組)于造模前1h經(jīng)腹腔給予G-1 120μg/(kg·d),假手術(shù)組(PO組)和肝缺血再灌注組(IR組)則于術(shù)前1h經(jīng)腹腔給予同等容積的生理鹽水。缺血再灌注6h、12h和24h共3個時間點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)本檢測,每個時間點(diǎn)6只大鼠。

1.3 動物模型建立 8周齡SD大鼠術(shù)前12h 禁食,腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉溶液30mg/kg 麻醉,上腹部正中切口開腹,斷離肝周韌帶后分離肝門部脈管,以無創(chuàng)傷小血管夾夾閉左外及中葉的肝動脈、門靜脈造成70%肝臟缺血,45min后重新開放血供并切除未阻斷血供的30%肝葉,造成肝切除肝缺血再灌注模型,分別在各時間點(diǎn)沿著大鼠劍突剪開胸腔,暴露心臟,右心室取4~6ml血液,分裝于Eppendoef導(dǎo)管中,室溫下1 000g離心10min分離出血清,-20℃保存待測。同時取肝左中葉組織,用冰生理鹽水沖洗后用10%甲醛溶液浸泡固定,制作石蠟切片。

1.4 全自動生化檢測儀檢測血清ALT水平 根據(jù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測試盒操作步驟完成大鼠缺血再灌注后6h、12h和24h的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測。

1.5 ELISA法測定血清白細(xì)胞介素1β(IL-1β) 取大鼠肝臟缺血再灌注后6h、12h和24h的血清,室溫血液自然凝固10~20min,離心20min左右(2 000~3 000r/min),仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心,經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為30ng/L、20ng/L、10ng/L、5ng/L、2.5ng/L),分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔,溫育、配液洗滌、加酶、再次溫育、再次洗滌、顯色(每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15min)、終止(每孔加終止液50μl,終止反應(yīng),此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)等步驟;最終測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值),測定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進(jìn)行。

1.6 TUNEL法觀察肝細(xì)胞的凋亡 取肝組織包埋與固定,脫蠟、水化、消化、制備TUNEL反應(yīng)混合液,加50μl TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37℃反應(yīng)1h;PBS洗3min×3次,加50μl POD于標(biāo)本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min,PBS洗3min×3次,DAB染色3~10min,自來水沖洗,蘇木素復(fù)染,1%鹽酸酒精分化,顯微鏡下觀察,控制染色程度,脫水:75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精,逐級脫水,各3min,透明:二甲苯透明3min×2次,中性樹膠封片,通過顯微鏡采集分析樣本相關(guān)部位,計算凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 血清轉(zhuǎn)氨酶水平變化 大鼠肝臟缺血再灌注后6h、12h及24h,PO組、IR組及GIR組血清ALT值在組間各時點(diǎn)分別兩兩對比,差異顯著(P<0.01),GIR組血清ALT值隨著再灌注時間的延長而逐漸下降,于再灌注6h達(dá)到峰值,到再灌注24h時漸漸接近PO組,見表1。

表1 大鼠肝缺血再灌注后各時點(diǎn)血漿ALT的活性比較

注:★P<0.01 VS PO組;▲P<0.01 VS IR組。

2.2 大鼠肝缺血再灌注后各時點(diǎn)凋亡率的變化 大鼠肝臟缺血再灌注后6h,PO組、IR組及GIR組的凋亡率兩兩對比,有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000、0.015、0.000),大鼠肝臟缺血再灌注后12h,三組的凋亡率兩兩對比,差異顯著(P=0.000、0.005、0.000),大鼠肝臟缺血再灌注后24h,三組肝細(xì)胞凋亡率兩兩對比,其中PO組及GIR組與IR組兩兩對比差異明顯(P=0.000),PO組與GIR組對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.265),GIR組隨著再灌注時間的延長,凋亡率逐漸下降,到再灌注24h時已顯著下降,接近PO組,見表2。

表2 大鼠肝缺血再灌注后各時點(diǎn)凋亡率比較研究

注:★P<0.01 VS PO組;▲P<0.01 VS IR組。

2.3 大鼠肝缺血再灌注后各時點(diǎn)大鼠血清白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)的變化 大鼠肝臟缺血再灌注后6h PO組、IR組及GIR組IL-1β值兩兩對比,差異顯著(P=0.000),大鼠肝臟缺血再灌注后12h,三組IL-1β值兩兩對比有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000),大鼠肝臟缺血再灌注后24h,三組IL-1β值兩兩對比有差別(P=0.000),隨著再灌注時間的延長,GIR組白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)水平逐漸下降,到再灌注24h時下降明顯,見表3。

表3 大鼠肝缺血再灌注后各時點(diǎn)白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)的變化情況

注:★P<0.01 VS PO組;▲P<0.01 VS IR組。

3 討論

肝缺血再灌注(Ischemia reperfusion,I/R)損傷常由炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激介導(dǎo),引起肝細(xì)胞的凋亡和壞死,進(jìn)而導(dǎo)致肝功能不全[2],隨著研究進(jìn)展,近年發(fā)現(xiàn)了與雌激素相關(guān)聯(lián)的第3種受體,即G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein-coupled estrogen receptor,GPER),雌激素可通過GPER介導(dǎo)的快速信號反應(yīng)來調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等[3],G-1和G-15分別是CPER高選擇性的激動劑和抑制劑,它們的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了GPER在細(xì)胞、組織和動物中的功能研究[4-5]。

本研究成果通過建立大鼠肝切除肝缺血再灌注模型,于造模前1h經(jīng)腹腔給予120μg/(kg·d)G-1預(yù)處理,于造模后6h、12h及24h取大鼠血清及肝組織標(biāo)本,分別檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度、肝細(xì)胞的凋亡情況發(fā)現(xiàn),肝臟缺血再灌注后,血清ALT活性明顯升高。在IR組和GIR組,大鼠肝臟缺血再灌注后各個時間點(diǎn)ALT活性明顯升高,且隨著再灌注時間的延長而逐漸下降,組間同時點(diǎn)比較,GIR明顯低于IR組(P<0.05),且隨著再灌注時間的延長GIR組血清ALT值漸漸接近PO組;通過TUNEL法檢測肝細(xì)胞的凋亡情況發(fā)現(xiàn),GIR組隨著再灌注時間的延長,G-1預(yù)處理組凋亡率逐漸下降,于再灌注6h達(dá)到峰值,到再灌注24h時已顯著下降,說明GPER激動劑G-1具有保護(hù)肝功能作用。

近期國內(nèi)相關(guān)學(xué)者[6]對GPER激動劑(G-1)對C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)GPER激動劑G-1可特異性降低IL-1β表達(dá),IL-1β的激活依賴NLRP3炎性小體的活化,GPER激動劑G-1可能抑制NLRP3炎性小體的活化,本研究通過ELISA法在大鼠肝缺血再灌注后各時點(diǎn)測定血清白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的變化,發(fā)現(xiàn)GPER激動劑G1預(yù)處理后,假手術(shù)組的IL-1β明顯低于GIR組及IR組(P<0.01),且隨著再灌注時間的延長,GIR組白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)水平逐漸下降,到再灌注24h時下降明顯,表明GPER激動劑G-1預(yù)處理能降低大鼠肝缺血再灌注損傷后的IL-1β水平,抑制炎性細(xì)胞聚集,減輕肝組織炎性浸潤和細(xì)胞凋亡,從而減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷,這說明GPER激動劑G-1在大鼠肝缺血再灌注損傷的作用可能與NLRP3炎性小體相關(guān)。

綜上所述,GPER激動劑G-1預(yù)處理大鼠肝缺血再灌注損傷后,隨著再灌注時間的延長,能降低肝轉(zhuǎn)氨酶(ALT),減少肝細(xì)胞凋亡率,從而起到肝保護(hù)作用,其可能作用是通過降低IL-1β水平,來抑制IL-1β產(chǎn)生減輕肝臟缺血再灌注損傷,其進(jìn)一步作用機(jī)制為GPER激動劑G-1可能是抑制NLRP3炎性小體的活化而發(fā)揮抗炎作用,從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞增殖,在肝臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)肝臟組織的功能有待我們進(jìn)一步研究。

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